1、四川理工學(xué)院,第六章 藥物的含量測定,藥分 制藥2011,第一節(jié) 概述,藥物的含量測定,評價藥物質(zhì)量的主要指標。運用化學(xué)、物理或生物化學(xué)的方法和技術(shù)，測定藥物中主要有效成分的含量。,定義,藥物的含量測定,化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)方法,方法,利用某些生物學(xué)特性或特殊反應(yīng)來定性、定量,化學(xué)反應(yīng),如光吸收特性、濁度,藥物的含量測定,基于化學(xué)或物理學(xué)原理的含量測定。,分兩類,基于生物學(xué)原理的效價測定。,基 礎(chǔ),生物檢定法，微生物檢定法，酶法。,目 標,含量測定。,含量方法要求,化學(xué)原料藥（API)：根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等特點綜合考慮適宜的含量測定法。選用的含量測定法應(yīng)能準確測試有效成分的含量，其準

2、確度和精密度均高。 制劑：可能時應(yīng)選用與原料藥相同的測定方法，共存藥物、輔料、附加劑有干擾時，可考慮增加預(yù)處理或改進方法,但專屬性要強。,含量表示方法,（一）原料藥含量的表示法 原料藥一般以百分含量表示，指樣品中被測成分（一般為活性物質(zhì)）的百分含量。一般按干燥品計算。 藥典凡例規(guī)定： “按干燥品（或無水物，或無溶劑）計算”時，除另有規(guī)定外，應(yīng)取未經(jīng)干燥（或未去水，或未去溶劑）的供試品進行試驗，并將計算中的取用量按檢查項下測得的干燥失重（或水分，或溶劑）扣除。,因此：含量%（干燥品計）=直接測得量（1-干燥失重）,（二）藥物制劑含量的表示法 一般以相當(dāng)于標示量的百分數(shù)表示，指一個制劑單位中平均含

3、有的藥物成分為制劑標準的“規(guī)格”項規(guī)定量的百分數(shù)。如：對乙酰氨基酚片，規(guī)格0.5g，經(jīng)含量測定測得平均每片含對乙酰氨基酚0.45g，則標示量為90%。,固體制劑含量測定結(jié)果的計算,原料藥,制劑,物質(zhì)的量 效價 生物學(xué)法（基于生物學(xué)原理）,藥物含量測定方法,化學(xué)法（基于化學(xué)原理） 容量分析法、重量分析,儀器分析法（基于物理學(xué)原理） 光譜法、色譜法,具體方法,容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、間接滴定法） 光譜分析法：UV、IR、 色譜分析法：HPLC、GC,第二節(jié)、容量分析法,為經(jīng)典方法，原料藥分析常采用。,常產(chǎn)生滴定誤差，如指示劑和儀器容量,特點： 1、快速,準確（RSD0.2）,靈敏

4、度高； 2、適合于中、高含量組分分析（1%）； 3、儀器簡單，操作方便，適用范圍廣；,按滴定方式分：,容量分析法分類,滴定度（T）： 每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的質(zhì)量(mg),酸堿滴定：在水溶液中以酸堿中和反應(yīng)來測定物質(zhì)含量的方法 配位（絡(luò)合）滴定法：以形成穩(wěn)定配合物的配位反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析法。 用于金屬離子的測定 采用金屬指示劑（如鉻黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二鈉） 氧化還原滴定法： 碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸鈉滴定液、淀粉指示劑 溴量法 ：Na2S2O3滴定液 、Br2滴定液,按反應(yīng)類型分：,沉淀滴定法：以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)，多以硝酸銀為滴定液，也稱銀量法。按所用指示劑的

5、不同分為 鉻酸鉀指示劑法 鐵銨礬指示劑法 吸附指示劑法 非水滴定法：在非水溶劑（有機溶劑與不含水的無機溶劑）中進行滴定分析的方法。 非水堿量法：是以冰醋酸為溶劑，高氯酸為滴定液，甲紫微指示劑，測定弱堿性藥物及其鹽類 非水酸量法：是在堿性溶液中，以甲醇鈉為滴定液，麝香草酚藍為指示劑，二甲基甲酰胺等為溶劑，滴定弱酸性藥物,滴定法的計算,滴定度(T)的計算 在容量分析中，被測藥物(B)與滴定液(A)之間都按一定的摩爾比進行反應(yīng)的，滴定反應(yīng)可表示為：,aA(待測物）bB（滴定液）cCdD,滴定液反應(yīng)的質(zhì)量,被測藥物反應(yīng)的質(zhì)量,被測藥物的摩爾質(zhì)量,滴定液的摩爾質(zhì)量,m滴定液濃度(mol/L) M被測物質(zhì)

6、分子量 a/b 為反應(yīng)式配平后滴定液與被測物的摩爾比,T =（a/b） mM,示例一 計算Vc的滴定度T,碘量法測定Vc含量M(C6H6O6)=176.13，C(I2)=0.05mol/L,Mb=0.05mol/L,1,1,MA=176.13,示例二 異煙肼的滴定度,溴酸鉀法測定異煙肼含量M(C6H7N3O)=137.14， C溴酸鉀=0.01667mol/L,a,b,直接滴定法計算公式,在實際工作中，滴定液的濃度可能與藥典規(guī)定的濃度并不一致，所以應(yīng)該進行校正,先計算T,再計算含量,正確求a和b,剩余滴定法計算公式,也叫回滴定法，本法常需空白試驗，含量測定結(jié)果的計算：,例題：非那西丁含量測定：

7、精密稱取本品0.3630g加稀鹽酸回流1小時后，放冷，用亞硝酸鈉液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亞硝酸鈉液（0.1mol/L）相當(dāng)于17.92mg的C10H13O2N。計算非那西丁的含量為？,例：精密稱取青霉素鉀供試品0.4021g，按藥典規(guī)定用剩余堿量法測定含量。先加入氫氧化鈉液(0.1mol/L)25.00ml，回滴時消耗0.1015mol/l的鹽酸液14.20ml，空白試驗消耗0.1015mol/l的鹽酸液24.68ml。求供試品的含量，每1ml氫氧化鈉液(0.1mol/L)相當(dāng)于37.25mg的青霉素鉀。,例非那西丁含量測定：精密稱取本品0.3630g加稀

8、鹽酸回流1小時后，放冷，用亞硝酸鈉液（0.1010mol/L）滴定，用去20.00m1。每1ml亞硝酸鈉液（0.1mol/L）相當(dāng)于17.92mg的C10H13O2N。計算非那西丁的含量為（ ） A. 95.55% B. 96.55% C. 97.55% D. 98.55% E. 99.72%,光譜分析法,藥典收載,紫外可見分光度法,原子吸收分光光度法,紅外分光度法,熒光分析法,火焰光度法,第三節(jié) 分光光度法,分光光度法: 是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。 光是電磁波,常用的波長范圍為： (1)200400nm-紫外光區(qū)； (

9、2)400760nm-可見光區(qū)； (3)7602500nm（12800cm-14000cm-1）-近紅外光區(qū) (4)2.525m（按波數(shù)計為4000cm-1400cm-1）-紅外光區(qū)。,紫外可見分光度法,方法特點與適用范圍,1、簡便易行：本法使用的儀器價格比較低廉，操作簡單，易于普及,2、靈敏度高：本法靈敏度可達10-710-4g/ml，適用于低濃度試樣分析,3、準確度較高：本法誤差在2%5%之間，適用于對測定結(jié)果的準確度要求較高的樣品,4、專屬性較差：本法通常不受一般雜質(zhì)的干擾，但對結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)缺乏選擇性。,本法比較少應(yīng)用于原料藥的含量測定，可用于制劑的含量測定，更多的應(yīng)用于生物制劑的

10、定量檢查,本法紫外區(qū)須選用石英比色皿，比色皿一般為1cm，吸光度在0.30.7之間為宜，選用最大吸收光波長。,紫外-可見分光光度法,物質(zhì)吸收紫外和可見光區(qū)的電磁波產(chǎn)生的吸收光譜 進行定性和定量分析的方法 1.基本原理：朗伯比耳定律 A為吸收度； T為透光率； L為液層厚度，單位為cm ； E為吸收系數(shù)，常用的是百分吸收系數(shù)和摩爾吸收系數(shù)表示； C為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的量g,吸收系數(shù),2.儀器的基本結(jié)構(gòu) 鎢燈（612V），產(chǎn)生3203200nm的連續(xù)光譜，其適宜的波長是3601000nm。 氫燈發(fā)射150400nm波長的光，適用于200400nm波長。,（2）吸收度的準確度 吸收度的準

11、確性用基準重鉻酸鉀硫酸溶液檢定60mgk2Cr2O7, 釋稀1000ml，在規(guī)定波長處測定吸收度，計算吸收系數(shù)E，相對誤差度在1%以內(nèi)。 （3）分辨率測定,（1）波長的準確度,3.儀器的校正和檢定,中國藥典2010版對吸光度的測定做了以下要求： （1）溶劑：要求：能溶解樣品，揮發(fā)性小，對光波吸收少。,4.吸光度的測定,（2）空白試驗校正：采用空白對照，將溶劑裝入吸收池，放入光路調(diào)節(jié)，儀器使吸收度為0（或透光率100%），然后再測樣品。 （3）測定波長的核對：為了提高測定靈敏度，減少測定誤差，吸收度一般應(yīng)在 測定，測定樣品的與文獻記載對照，應(yīng)在規(guī)定波長2nm以內(nèi)。 （4）供試品溶液的濃度：為了減

12、少誤差，應(yīng)考慮使吸光度在0.30.7范圍內(nèi),（）對照品比較法： （）吸收系數(shù)法 ： （）標準曲線法：,5.含量測定：,(1)對照法,(2)吸收系數(shù)法計算,(3)標準曲線法,配制系列濃度的對照品溶液，在max處測吸收度A，做吸光度濃度曲線，測試樣品時，根據(jù)A在標準工作曲線上查C。,（1）空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應(yīng)預(yù)先過濾，并棄去初濾液。 （2）測定時，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池。 （3）在測定時或改測其它檢品時，應(yīng)用待測溶液沖洗吸收池34次，用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損），放入樣品室

13、每次方向應(yīng)一致。 （4）取吸收池時，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及時用測定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防塵保存。若吸收池內(nèi)外壁沾污，用脫脂棉纏在細玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕擦試，再用純化水沖凈。 （5）儀器經(jīng)過搬動請及時檢查并糾正波長精度，并應(yīng)經(jīng)常校準波長精度。,6.注意事項,特點： 靈敏度高，可達10-1010-12g/ml 要求低濃度下測定 須做空白測定 熒光弱的藥物可衍生化后測定,二、熒光分析法,第四節(jié) 色譜分析法,色譜法：是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。 分離機制：分配、吸附、離子交換、分子排阻及親合色譜法 優(yōu)點

14、：高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快、應(yīng)用范圍廣。 應(yīng)用：各國藥典中廣泛用作純度檢查、含量測定。 分類： 流動相：氣體氣相色譜法 液體液相色譜法 固定相：固體或液體 氣固色譜法；氣液色譜法；液固色譜法；液液色譜法 操作形式：柱色譜法、平板色譜法、電泳法,一、HPLC色譜法及定量方法,（一）主要參數(shù)： 1.基線：沒有樣品進入檢測器時，噪音隨時間的變化。 2.保留時間tR：從進樣到組分色譜峰頂點的時間,3.峰高h /峰面積：從最高點到基線的距離（峰與基線圍成的面積）。 4.峰寬W：拐點作切線在基線上的載距。W越窄柱效高。 5.半峰寬Wh/2點：峰高一半處的峰寬。 6.理論塔板數(shù)： n=5.54

15、(tR/wh/2)2 ， 一般n103 ，n越 大柱效高,7.分離度 R2（tR2tR1）/（W1W2） R1.5 認為分離完全,（二）基本原理 待分離物質(zhì)在兩相間進行分配時，在固定相中溶解度較小的組分，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定相中溶解度較大的組分，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達到分離的目的。 依固定相與流動相極性的不同，分為正相色譜和反相色譜 1.正相色譜法 流動相極性小于固定相 一般用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動相，主要用于分離極性化合物，極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。 2.反相色譜法 流動相極性大于固定相 一般用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑

16、(如水、甲醇、己腈等)作流動相，主要用于分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。,（三）固定相和流動相,1.固定相 常用化學(xué)鍵合相，分極性和非極性鍵合相，如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18或ODS）和辛基硅烷鍵合硅膠（C8）為最常用的非極性鍵合相，用于反相色譜法； 氨基和氰基硅烷鍵合相為常用的極性鍵合相，用于正相色譜法。 2.流動相 有機溶劑+水混合 一般為色譜純試劑，經(jīng)0.45um的微孔濾膜過濾，需脫氣處理,（四）儀器的基本結(jié)構(gòu),1.色譜柱,柱管-不銹鋼，填充硅膠和化學(xué)鍵合固定相 內(nèi)徑4.6mm 長15cm、20cm和25cm的三種， 如安捷倫色譜柱、 Waters色譜

17、柱、迪馬色譜柱等。,2.檢測器,常用紫外檢測器 其次有二極管陣列檢測器(DAD) 熒光檢測器 示差折光檢測器 蒸發(fā)光散射檢側(cè)器 電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等,（五） 系統(tǒng)適用性試驗,定義：指用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進行試驗， 應(yīng)符合要求。 包括 柱溫、柱長、固定相、流動相； 理論板數(shù)：說明分離過程，色譜柱的塔板數(shù)越多，柱效越高； 分離度：應(yīng)大于1.5； 重復(fù)性：相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%； 等；,（六）在雜質(zhì)檢查和含量測定中的應(yīng)用,1.內(nèi)標法（加校正因子） 方法： 內(nèi)標物+對照品對照溶液，進樣，測定，計算校正因子。,CR對照品濃度,As內(nèi)標物峰面積,CS內(nèi)標物濃度,AR對照品峰面積,供試品+內(nèi)

18、標供試品溶液，進樣，測定供試品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，計算含量,Cx樣品濃度,Ax樣品峰面積,例.HPLC法測定鹽酸阿夫唑嗪片（規(guī)格：5mg）的含量：取鹽酸特拉唑嗪約20mg，稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標溶液。取鹽酸阿夫唑嗪對照品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液，精密取該儲備液1ml，置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶液5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液；另取本品20片，精密稱定，研細，精密稱細粉適量（約相當(dāng)于阿夫唑嗪10mg），置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，

19、取續(xù)濾液10ml，置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶液5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別精密取對照品溶液和樣品溶液各20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按內(nèi)標法以峰面積計算含量。,操作：對照品取樣為10.1mg，20片重為1.6020g，取樣細粉稱重158.2mg，測得對照品溶液中鹽酸阿夫唑嗪和內(nèi)標的峰面積分別為5470124和6126012，樣品溶液中阿夫唑嗪和內(nèi)標的峰面積分別為5219986和61198978，計算本品的含量。,解： 對照品濃度：0.0101mg/ml,內(nèi)標濃度：0.01mg/mg f=(AS/CS)/(AR/CR)=(6126012/0.01)/(547

20、0124/0.0101) =1.13 CX=fAX/(AS/CS)=1.135219986/(6119898/0.0100) =0.009735mg/ml =（0.00973510010/158.2)（1.6020/20）/5100%=98.58%,例.HPLC法測定單硝酸異山梨酯注射液（規(guī)格：5ml:20mg）的含量：取間三甲氧基苯約20mg，稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得內(nèi)標溶液。取單硝酸異山梨酯對照品約8mg，精密稱定，置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標溶液5ml，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品2ml，同法測定，按內(nèi)

21、標法以峰面積計算含量。已知：對照品取樣為8.1mg，測得對照品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標的峰面積分別為5467824和6125843，樣品溶液中單硝酸異山梨酯和內(nèi)標的峰面積分別為5221345和6122845，計算本品的含量。,解：f=(AS/CS)/( AR/CR)=(6125843/0.01)/(5467824/0.081)=9.07 CX=fAX/(AS/CS)=9.075221345/(6122845/0.01)=0.07735mg/ml,=(0.7735100/5)2/20100%=96.68%,2.外標法,對照液（R）： AR CR,供試液（X）： AX CX,CX CR,AX A

22、R,CX,CR AX,AR,要求：進樣量準確、操作條件穩(wěn)定,A總=Ai=A1+A2+An (%)=Ai / A總100% 例題7 用氣相色譜法檢查大豆油的脂肪酸組成，相應(yīng)于棕櫚酸、硬酯酸、油酸、亞油酸和亞麻酸的峰面積分別為129758、43286、296522、654868、92570，按峰面積歸一化法，計算上述脂肪酸的百分含量。,3、面積歸一化法,二、氣相色譜法,1.分離原理 注入進樣口的樣品經(jīng)加熱氣化后，被載氣帶入色譜柱，由于其分配系數(shù)的不同進行分離，各組分先后進入檢測器，信號記錄儀、積分儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。分配系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出。,2.色譜儀的基本結(jié)構(gòu)

23、由載氣源、進樣器、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成,.載氣（流動相）：,如氦、氮和氫等 .進樣器：直接進樣或頂空進樣 微量注射器,. 固定相和載體 色譜柱為填充柱或毛細管柱 常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。,毛細管柱填充柱,. 檢測器 火焰離子化檢測器（FID)、 熱導(dǎo)檢測器(TCD)、 氮磷檢測器（NPD)、 火焰光度檢測器(FPD)、 電子捕獲檢測器(ECD)、 質(zhì)譜檢測器(MS),.色譜系統(tǒng)適用性和含量測定中的應(yīng)用 同高效液相色譜法,第五節(jié) 藥品含量測定方法驗證,1 專屬性 2 線性及其范圍 3 精密度 4 準確度 5 檢測限 6 定量限 7 耐用性,一、專屬性(Specificity),指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性。 分析復(fù)雜樣品混合物時衡量其是否受到干擾的一種方法。,A- 對照品,B- 樣 品,C- 陰 性,二、線性與范圍(Linearity And Range),線性：在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與被測物濃度呈正比關(guān)系的程度。 Y=a+bx （r0.999) 范圍：達到一定精密度、準確度和線性的條件下，