1、,肝炎分子診斷項(xiàng)目開展介紹 -艾迪康市場(chǎng)部,目 錄,1、了解肝炎分子診斷 2、分子診斷在HBV中的臨床應(yīng)用 3、分子診斷在HCV中的臨床應(yīng)用 4、ADICON已開展的肝炎分子診斷項(xiàng)目,我國(guó)乙肝病毒感染率概況,20062010年全國(guó)乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃顯示，中國(guó)是乙型肝炎病毒感染和發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家，全國(guó)有6.9億人曾感染過乙肝病毒，其中1.2億人長(zhǎng)期攜帶乙肝病毒。 目前全國(guó)慢性乙肝病人2000萬人，每年死于與乙肝相關(guān)的肝病患者達(dá)28萬例，發(fā)病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)3600億元人民幣。,我國(guó)乙肝病毒感染率概況,什么是分子診斷,在臨床上應(yīng)用核酸（DNA/RNA) 和分

2、子生物學(xué)技術(shù), 在基因水平診斷和監(jiān)控疾病情況和療效，評(píng)估疾病的檢測(cè)方法。,分子技術(shù)在乙肝診斷與治療中應(yīng)用,高靈敏度乙肝DNA檢測(cè),高精度病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）,高靈敏度乙肝DNA檢測(cè)優(yōu)勢(shì),定量PCR技術(shù)檢測(cè)患者的血清HBVDNA含量，能更準(zhǔn)確地反映病毒復(fù)制程度，對(duì)HBV相關(guān)疾病的診斷、治療、判斷預(yù)后意義重大。 QF-PCR是國(guó)內(nèi)常用的定量檢測(cè)血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系統(tǒng)是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于血清HBVDNA定量檢測(cè)的方法。它具有靈敏度高，線性范圍廣，實(shí)時(shí)監(jiān)控，重復(fù)性好，可檢測(cè)A、B、C、D、E、F、G

3、、前C區(qū)變異等多基因型DNA載量?jī)?yōu)點(diǎn)。 由于本QF-PCR試劑盒的線性范圍為1.0 x 103 copiesmL1.0 x 108 copiesmL，對(duì)于低于1.0 x 103 copiesmL標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果不能給出具體拷貝值，有存在漏檢的可能。 而COBAS 系統(tǒng)線性范圍為20-1.7108 IU/mL，因此， COBAS 系統(tǒng)更能準(zhǔn)確反映血清HBV DNA含量。,COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0,Cobas,高靈敏度 乙肝：20 IU/mL,準(zhǔn)確判斷治療起點(diǎn)/終點(diǎn),線性范圍 乙肝：20-1.7108 IU/mL,極佳的重復(fù)性，結(jié)果可靠

4、正確指導(dǎo)抗病毒治療,每批試劑均使用WHO標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn),保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性 和可溯源性,每個(gè)樣本使用同源性內(nèi)標(biāo)定量,避免結(jié)果不準(zhǔn)確,采用AmpErase酶,減少交叉污染,目前在國(guó)內(nèi)唯一滿足治療指南和專家共識(shí)的HBV DNA和 HCV RNA檢測(cè)試劑,HBV DNA 監(jiān)測(cè)的重要性 口服核苷（酸）類似物療效評(píng)估,部分病毒學(xué)應(yīng)答 60 2,000 IU/mL 加其他藥物治療 每3個(gè)月監(jiān)測(cè)HBV DNA,*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897.,抗病毒治療應(yīng)將HBV DNA降至盡可能低的濃度，理想是低于實(shí)時(shí)定量 PCR方法（靈敏度10-1

5、5 IU/mL）的最低檢出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242,CHB疾病管理:治療目標(biāo),HBsAg 清除及血清學(xué)轉(zhuǎn)換,治療終點(diǎn),ALT正常,組織學(xué)改善,HBV DNA 降低/消失,HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換,HBeAg消失,cccDNA 清除,*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9,治療終點(diǎn),2009年EASL指南提出的治療終點(diǎn)： 最理想的治療終點(diǎn)：持續(xù)的HBsAg 消失

6、，伴或不伴抗HBs 抗體出現(xiàn)。 滿意的治療終點(diǎn)：在HBe Ag 陽(yáng)性患者中，出現(xiàn)持續(xù)的HBeAg 血清轉(zhuǎn)換 次級(jí)的滿意治療終點(diǎn)：盡可能降低病毒DNA水平（降至實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)限以下：10-15IU/ml）,HBV基因分型,根據(jù)HBV全基因核苷酸序列的差異，分為不同基因型:A.B.C.D.E.F.G.H共8個(gè)型 不同的基因型具有不同地域分布 我國(guó)主要是BC型為主，偶有A型 北方C型,HBV基因分型檢測(cè)臨床意義,HBV變異的基礎(chǔ),乙肝病毒:高變異性 1/105 24h 一萬億-十萬億拷貝*變異：一千萬一億 復(fù)制過程:DNA-RNA-DNA HBV逆轉(zhuǎn)錄酶:缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制 變異:自然變異,免

7、疫壓力等等,P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測(cè),HBV病毒耐藥性檢測(cè),長(zhǎng)期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點(diǎn)主要集中于P區(qū) 原因：抗病毒藥物作用在病毒P區(qū)藥物靶點(diǎn)上，引起相關(guān)基因變異，使得藥物與相關(guān)靶點(diǎn)作用下降，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥。,抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥,原發(fā)無應(yīng)答,病毒學(xué)（部分）應(yīng)答,臨床耐藥,抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥,病毒耐藥的臨床影響,耐藥病毒的出現(xiàn)使后續(xù)治療的藥物療效降低 耐藥病毒的出現(xiàn)抵消了之前獲得的臨床益處 病毒反彈, 血清轉(zhuǎn)氨酶升高, HBeAg血清轉(zhuǎn)換率降低 肝臟病理進(jìn)展 肝硬化病人出現(xiàn)肝功能失代償和死亡 肝移植后肝炎復(fù)發(fā)率增高 公共衛(wèi)生危害 耐藥病

8、毒株的傳播 免疫逃逸,Liaw et al. 1999. Hepatology 30: 567,病毒的水平越低，耐藥發(fā)生的幾率越低,初治患者耐藥發(fā)生率,拉米夫定,阿德福韋,恩替卡韋為基因型耐藥發(fā)生率, 替比夫定為因耐藥發(fā)生的病毒學(xué)反彈發(fā)生率,P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測(cè),長(zhǎng)期使用抗病毒藥物可引起HBV耐藥，引起耐藥的基因突變位點(diǎn)主要集中于P區(qū) 耐藥基因分析在臨床藥物選擇上的應(yīng)用 目前最常見P區(qū)耐藥位點(diǎn)11個(gè) （169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250）,拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他濱 V173L L180M M204I/V 阿德福韋

9、 A181V N236T 恩替卡韋 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V,常用抗病毒藥物的耐藥位點(diǎn),常見變異的交叉耐藥性,敏感,界于中間,耐藥,抗病毒藥物的選擇和使用,1.一種藥物產(chǎn)生耐藥時(shí)，需要用具有不同耐藥位點(diǎn)藥物代替 2.為減少耐藥情況，建議從治療開始就使用具有兩種不同耐藥位點(diǎn)藥物一起治療 3.由于抗病毒藥物的耐藥以及治療的長(zhǎng)期性，在治療過程中應(yīng)該定期檢查，或是在發(fā)現(xiàn)藥物治療效果不佳時(shí)需排除產(chǎn)生耐 藥的可能,藥物治療慢性乙肝患者管理路線圖,檢測(cè),檢測(cè),檢測(cè),檢測(cè),耐藥檢測(cè)項(xiàng)目,目前檢測(cè)的變異位點(diǎn)： P區(qū)耐藥位點(diǎn)11個(gè) （169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250） 專門檢測(cè)LAM變異位點(diǎn)：180，181，204，173 專門檢測(cè)ADV變異位點(diǎn)：181，233，236,艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心P區(qū)基因變異檢驗(yàn)報(bào)告單樣張,丙型肝炎病毒,傳播途徑:主要血液/體液傳播(似HBV) 是引起輸血后慢性肝炎和肝硬化主要原因 無癥狀HCV攜帶者和慢性丙肝者多見 感染HCV后，慢性化的比例高達(dá)50%以上 免疫力不牢固,黃病毒科 丙型肝炎病毒屬 球形有包膜的RNA病毒，直徑50nm 病毒基因?yàn)閱喂烧淩NA，鏈全 長(zhǎng)約10Kb,HCV RNA 檢測(cè),確定引起