1、細(xì)胞培養(yǎng)之無菌操作,目錄,無菌 定義：對一個環(huán)境所謂的無菌，是指在環(huán)境中一切有生命活動的微生物的營養(yǎng)細(xì)胞及其芽胞或孢子都不存在 無菌技術(shù) 定義：無菌技術(shù)是細(xì)胞工程的基本技術(shù)包括實驗器具和材料的準(zhǔn)備、培養(yǎng)室和超凈臺的消毒、洗手和著裝、無菌操作等 意義：因體外培養(yǎng)細(xì)胞沒有抗感染能力，防止污染則是決定培養(yǎng)成功與否的首要條件，即便是在設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會導(dǎo)致污染。為在一切操作中盡可能保證無菌，每一項工作我們都必須做到有條不紊和完全可靠。 消毒滅菌 消毒：是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細(xì)菌芽孢的方法。通常用化學(xué)的方法來達到消毒的作用。用于消毒的化學(xué)藥物叫做消毒劑。

2、 滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。,消毒劑種類,依據(jù)化學(xué)成分主要分為9種 醛類消毒劑 雜環(huán)類消毒劑 含氯消毒劑 過氧化物類消毒劑 含碘消毒劑 季銨鹽類消毒劑 酚類消毒劑 胍類消毒劑 醇類消毒劑 重金屬類消毒劑 生物類消毒劑,消毒,新潔爾滅消毒液 原理：新潔爾滅滅菌原理為破壞細(xì)胞膜、改變其滲透性而起殺菌作用 84消毒液 84消毒液是一種以次氯酸鈉為主的高效消毒劑，主要成分是次氯酸鈉，次氯酸鈉的漂白性是其與水反應(yīng)生成的次氯酸所帶來的，因次氯酸具有極強的氧化性，能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)物質(zhì)氧化，使其變性，因而能起到消毒

3、作用,消毒,75%酒精消毒原理 酒精之所以能消毒是因為酒精能夠吸收細(xì)菌蛋白的水分，使其脫水變性凝固，從而達到殺滅細(xì)菌的目的。如果使用高濃度酒精，對細(xì)菌蛋白脫水過于迅速，使細(xì)菌表面蛋白質(zhì)首先變性凝固，形成了一層堅固的包膜，酒精反而不能很好地滲入細(xì)菌內(nèi)部，以致影響其殺菌能力。75%的酒精與細(xì)菌的滲透壓相近，可以在細(xì)菌表面蛋白未變性前逐漸不斷地向菌體內(nèi)部滲入，使細(xì)菌所有蛋白脫水、變性凝固，最終殺死細(xì)菌，酒精濃度低于75%時，由于滲透性降低，也會影響殺菌能力。,潔凈級別無菌藥品生產(chǎn)所需的潔凈區(qū)可分為4個級別,A級：高風(fēng)險操作區(qū)，如灌裝區(qū)、放置膠塞桶和與無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區(qū)域及無菌裝配或連

4、接操作的區(qū)域，應(yīng)當(dāng)用單向流操作臺（罩）維持該區(qū)的環(huán)境狀態(tài)。單向流系統(tǒng)在其工作區(qū)域必須均勻送風(fēng)，風(fēng)速為0.36-0.54m/s（指導(dǎo)值）。應(yīng)當(dāng)有數(shù)據(jù)證明單向流的狀態(tài)并經(jīng)過驗證。在密閉的隔離操作器或手套箱內(nèi)，可使用較低的風(fēng)速。 B級：指無菌配制和灌裝等高風(fēng)險操作A級潔凈區(qū)所處的背景區(qū)域。 C級和D級：指無菌藥品生產(chǎn)過程中重要程度較低操作步驟的潔凈區(qū)。,實驗器具和材料的準(zhǔn)備,在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作計劃，有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需耗材物品及試劑，清點無誤后將其放置在操作場所進行消毒處理。 凡是需要帶入安全柜（超凈臺）的培養(yǎng)基、胰酶、培養(yǎng)皿（培養(yǎng)瓶）等耗材和試劑在經(jīng)

5、過消毒處理之后再用75%的酒精棉球擦拭表面。,培養(yǎng)室的消毒,進入無菌實驗室前先穿好無菌服、戴帽子及口罩 無菌實驗室每周用0.2%的新潔爾滅拖洗地面、粘塵桿去除灰塵，再用臭氧消毒 室內(nèi)臺面要保持潔凈，做完實驗后用75酒精或千分之三新潔爾滅棉球擦拭超凈工作臺的臺內(nèi)、邊臺的臺面、倒置顯微鏡的載物臺等 實驗所用物品盡可能一次性準(zhǔn)備好，避免多次出入,洗手和著裝,洗手和著裝,洗手和著裝,洗手和著裝,無菌操作個人防護,在實驗室工作時必須使用個體防護裝備 個人衣服和普通實驗服不能穿入細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi) 實驗室內(nèi)不能穿長擺裙，短裙及短褲，不得在實驗室內(nèi)穿露腳趾的鞋子 實驗室內(nèi)嚴(yán)禁處理和配戴眼鏡 嚴(yán)禁穿著細(xì)胞培養(yǎng)室專用

6、防護服離開實驗室 發(fā)生手套破損應(yīng)立即更換,無菌操作超凈臺的消毒,超凈工作臺臺面每次實驗前要用75%酒精擦洗，然后用紫外線消毒30min 在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線 消毒時工作臺面上用品不可過多堆放，否則會遮擋射線降低消毒效果 一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒,超凈工作臺,超凈臺是做一般對人體沒有直接傷害的常規(guī)細(xì)菌的操作實驗，正壓送風(fēng)，工作臺工作區(qū)域的氣流形成為水平層流型。區(qū)內(nèi)空氣經(jīng)初效過濾器過濾后，由風(fēng)機壓入靜壓箱，再經(jīng)高效過濾器過濾，由此送出的潔凈氣流，以一定的均勻斷面風(fēng)速通過操作區(qū)將塵埃顆粒帶走，從而形成高潔

7、凈的工作環(huán)境。超凈空氣的流速為，這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒,生物安全柜,生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒來用，操作區(qū)域是負(fù)壓，簡單說是往上處抽風(fēng)的，當(dāng)然致病菌也不是直接抽出排到室外，是過濾在生物安全柜的頂部漏器上，從排風(fēng)量上可以分為，50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜內(nèi)所形成的幾乎沒有微生物的環(huán)境中，盡量避免使用明火，酒精燈的火焰可能會影響室內(nèi)的氣流平衡。,無菌操作器皿的消毒,所有用到的器皿（買時已滅菌的除外）都必須經(jīng)過高壓滅菌烘干后才能放入超凈臺內(nèi) 已滅菌的、外包裝完好的培養(yǎng)瓶、離心管、凍

8、存管等可以表面經(jīng)75%酒精擦拭后直接放入超凈臺 凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面,無菌操作細(xì)胞處理,超凈臺經(jīng)過30min紫外滅菌后，才能打開通風(fēng)裝置 開始工作的第一步就是點燃酒精燈，之后的一切操作都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸，繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火 進行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿內(nèi)部，如已接觸，則取備品更換 不同種細(xì)胞實驗分次處理，以免交叉污染,無菌操作細(xì)胞處理,培養(yǎng)瓶打開后，應(yīng)平放在臺面，瓶口保

9、持斜向上 打開的培養(yǎng)液瓶口也應(yīng)保持適度傾斜放置，避免瓶口垂直放置 在具體操作過程中，也應(yīng)注意所有的瓶口保持傾斜，手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管丟掉 吸取營養(yǎng)液、 PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染,無菌操作物品擺放,為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央 培養(yǎng)的細(xì)胞較多時，打開的培養(yǎng)瓶蓋應(yīng)按照一定的順序擺放，保證瓶子之間的蓋子不會亂蓋,無菌操作培養(yǎng)瓶的拿取,從培養(yǎng)箱內(nèi)取培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶之前，先用酒精消毒雙手，

10、再取培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶 做鏡下觀擦?xí)r，保持蓋子是擰緊狀態(tài) 操作結(jié)束后，培養(yǎng)瓶先擰緊瓶蓋，經(jīng)75%酒精擦拭后放入培養(yǎng)箱 培養(yǎng)瓶蓋、胰酶瓶等的蓋子只有在要取液時方能打開，取完后立即燒灼旋緊。,無菌操作結(jié)束后消毒,實驗結(jié)束后，規(guī)范熄滅酒精燈，用75%酒精棉球擦拭超凈臺內(nèi)部，操作區(qū)域至少擦拭3次 超凈臺外部，操作口處用75%酒精棉球擦拭 消毒結(jié)束后，拉下超凈臺玻璃門，打開超凈臺紫外30min 離開培養(yǎng)室時，注意關(guān)閉照明燈，打開紫外燈,污染及其防治處理,化學(xué)污染物（培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑） 生物污染物（細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染）,生物污染細(xì)菌,細(xì)菌：是

11、一大類廣泛存在的單細(xì)胞微生物。直徑一般為幾個微米，外形多樣（球狀、桿狀盒螺旋狀）。培養(yǎng)物被細(xì)菌污染后，幾天內(nèi)即可通過簡單的肉眼觀察發(fā)現(xiàn)：被感染的培養(yǎng)物通常呈渾濁狀，在低背景下可見移動的微小顆粒，高倍鏡下可分辨各個細(xì)菌的形狀。,生物污染酵母,酵母是真菌界的一種單細(xì)胞真核微生物,大小從數(shù)微米到40微米不等。與細(xì)菌污染類似。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒。有些會芽生出較小的顆粒。,生物污染霉菌,霉菌是真菌界的一種真核微生物，已被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長。一般情況下，霉菌污染是較易發(fā)現(xiàn)辨別的。,生物污染病毒,病毒是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進行復(fù)制。病毒體積極小，因此要檢測培養(yǎng)

12、物中有無病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實驗室所用試劑中去除都十分困難。通過電子顯微鏡檢查、一組抗體的免疫染色、ELISA實驗或者采用適當(dāng)病毒引物的PCR技術(shù)可以檢測出細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒污染。,生物污染支原體,支原體是一種沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠進行自我復(fù)制的最小微生物。由于體積極小，支原體的檢測十分困難。唯一切實有效的檢測支原體污染的方法就是采用熒光染色、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或者微生物學(xué)測定技術(shù)定期檢測培養(yǎng)物。,無支原體細(xì)胞,支原體感染細(xì)胞,用熒光染料Hoechst33258染色，此染料能與DNA特異結(jié)合，可是支原體內(nèi)DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面合,生物污染交叉污染,交叉污染雖不如微生物污染普遍，但許多細(xì)胞系與HeLa細(xì)胞及其他生長迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是一個明確的問題會造成嚴(yán)重后果。細(xì)胞的生長特性、形態(tài)會發(fā)生變化。無法進行實驗研究。 在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)菌帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞 細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng),污染防治,在生產(chǎn)過程中，從器皿的洗滌、生產(chǎn)所需物品的準(zhǔn)備到細(xì)胞的生產(chǎn)所有的工作人員必須按照GMP和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成各項工作。