1、核酸的分離與純化,2020/9/21,2,核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子分開。 在分離核酸時，應(yīng)遵循兩個原則：一是保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；二是盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度。,2020/9/21,3,核酸分離與純化的過程一般都包括了材料的選擇、核酸的釋放、核酸與其它生物大分子的分離、核酸的純化與鑒定、核酸的濃縮、保存等幾個主要步驟。 每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)。,2020/9/21,4,一、材料的選擇,臨床常見的標(biāo)本血液、組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞等都可作為提取核酸的原料，具體實驗材料的選擇應(yīng)根據(jù)實驗的目的來確定。,2020/9/21,5,二、

2、核酸的釋放,（一）機械法 包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細(xì)胞破碎，但機械力也可引起高分子量線性分子的斷裂，因而不適用于染色體DNA的分離純化。,2020/9/21,6,（二）化學(xué)法 在一定的pH 環(huán)境下，加入表面活性劑或強離子劑使細(xì)胞裂解，蛋白質(zhì)和多糖沉淀，核酸被從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。向緩沖液中加入一些金屬離子螯合劑抑制核酸酶的活性，保護核酸不被降解。,2020/9/21,7,（三）酶法 通過加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使細(xì)胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。 溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺

3、和N-乙酰胞壁酸殘基間的-1,4 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種肽鍵，且在65及有EDTA、尿素和去垢劑如0.5%SDS 或 1%Triton X-100 存在時仍保留有酶活性，對于高分子量核酸的提取有很大的優(yōu)勢。,三、核酸的分離與純化,（一）核酸分離純化的基本方法,2020/9/21,10,1. 酚抽提法 細(xì)胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液，混勻后離心分離。蛋白質(zhì)被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。在含核酸的水相中加入醋酸鉀或醋酸鈉，形成核酸鹽，核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀，離心得到的核酸可以用70%乙醇洗滌以除去多余的鹽分，即可獲得一定純度的核酸。,2020/9

4、/21,11,2. 層析法 包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等。因分離和純化同步進(jìn)行，并且有商品試劑盒供應(yīng)而被廣泛應(yīng)用于核酸的純化。在一定的離子環(huán)境下，核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。,2020/9/21,12,3.密度梯度離心法 雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度，因而可經(jīng)密度梯度離心的方法形成不同密度的純樣品區(qū)帶，該法適用于大量核酸樣本的制備。,2020/9/21,13,氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。 氯化銫是核酸密度梯度離心的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)，梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合，離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射產(chǎn)

5、生熒光而被檢測。用注射針頭穿刺回收后，通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。,（二）基因組DNA的分離純化,哺乳動物基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線,2020/9/21,16,1.酚抽提法 以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要行透析或沉淀處理，獲得所需的DNA樣品。,2020/9/21,17,DNA酚抽提法示意圖,一、酚抽提法,2020/9/21,18,主要試劑的作用： EDTA： 二價金屬螯合劑，抑制核酸酶； 降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,2020/9/21,19,SDS的作

6、用： 溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂； 溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來； 對RNA、DNA酶有抑制作用； 與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。,2020/9/21,20,蛋白酶 K： 水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。 蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可 同時使用。,2020/9/21,21,酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。 PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。 在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)

7、定性。,2020/9/21,22,為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？,苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，如果直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。使用飽和酚可以減少酚吸收更多的DNA，降低DNA的損失率。,2020/9/21,23,2. 甲酰胺解聚法 細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法相似，但不進(jìn)行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物（即染色質(zhì)），然后通過火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶和有機溶劑。,2020/9/21,24,3. 玻棒纏繞法 以鹽酸胍裂解細(xì)胞

8、，制備的DNA分子量只有大約80kb，其長度不適用于構(gòu)建基因組DNA文庫，但用于Southern雜交和PCR反應(yīng)都可以獲得很好的結(jié)果。 該法簡單快速，可同時提取多個樣品。,2020/9/21,25,4異丙醇沉淀法 通過SDS和蛋白酶K消化與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并失活DNA酶，酚氯仿抽提去除蛋白質(zhì)后，用2倍容積的異丙醇來沉淀含0.1mol/L NaCl的DNA溶液，DNA沉淀是絲狀，而RNA在異丙醇溶液中仍為可溶狀態(tài)，利用這一物理特性從DNA中去除RNA，省去了加RNA酶消化RNA的步驟 。,（三）質(zhì)粒DNA的分離純化,2020/9/21,27,質(zhì)粒,質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀

9、DNA分子。 其大小范圍從lkb至200kb以上不等，已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，這些質(zhì)粒都是獨立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。,2020/9/21,28,質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值，因而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術(shù)。,2020/9/21,29,選擇哪種方法制備質(zhì)粒DNA，應(yīng)考慮以下因素： 1菌株類型 2質(zhì)粒的大小 3細(xì)菌染色體DNA變性條件強弱的控制 4細(xì)菌的培養(yǎng)與收集,2020/9/21,30,1. 堿裂解法 在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞

10、壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA。 細(xì)胞裂解后，細(xì)胞壁碎片與變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鉀鹽條件下，可有效沉淀，而質(zhì)粒DNA保留于上清中。通過無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，并用70%的乙醇洗滌，獲得的DNA純度可滿足測序與PCR等實驗的要求。,2020/9/21,31,一、堿裂解法,堿裂解法示意圖,2020/9/21,32,2. 煮沸裂解法 是將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100和溶菌酶的緩沖液中，Triton X-100和溶菌酶破壞細(xì)胞壁后，沸水浴裂解細(xì)胞的同時可破壞DNA鏈的堿基配對，并使宿主細(xì)胞的蛋白

11、質(zhì)與染色體DNA變性，但共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈。當(dāng)溫度下降后，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA可重新恢復(fù)其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的質(zhì)粒DNA。 適用于小質(zhì)粒DNA（15kb）的制備。,2020/9/21,33,3. SDS裂解法 是將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁，去壁細(xì)菌再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲液中，然后用酚/氯仿抽提。 該法有利于大質(zhì)粒DNA（15kb）的提取。,2020/9/21,34,4. 小量一步提取法 直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，同時完成細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)變性兩個過程，然后離心去除大

12、部分胞核DNA與蛋白質(zhì)，最后從上清中回收質(zhì)粒DNA。 該法簡單快速、經(jīng)濟可行，可用于內(nèi)切酶圖譜分析。,2020/9/21,35,5. 質(zhì)粒DNA的純化 （1）聚乙二醇沉淀法 質(zhì)粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA，并用RNase消化小分子RNA；然后在高鹽條件下，用PEG選擇性地沉淀大的質(zhì)粒DNA；沉淀的質(zhì)粒DNA進(jìn)一步用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。,2020/9/21,36,（2）柱層析法 柱層析法純化質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵是其填充的樹脂。 樹脂可分為兩類：一類是利用疏水的相互作用來純化質(zhì)粒DNA樣品；一類則通過離子交換與吸附的相互作用進(jìn)行純化。 以硅基質(zhì)作為填充材料的柱層析，其作用原理是在

13、多鹽條件下，依靠DNA與硅基質(zhì)的可逆性結(jié)合來進(jìn)行純化。通過暴露的磷酸鹽殘基，DNA吸附到硅基質(zhì)上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖類等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通過離心洗脫出來。,2020/9/21,37,（3）CsCl-EB法 是一種沉降平衡離心法。經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。其中蛋白質(zhì)密度?。?.3 g/cm31.4g/cm3），浮于液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉于管底；各種DNA密度介于蛋白質(zhì)與RNA之間，處于中部。,2020/9/21,38,EBCsCl密度梯

14、度離心法示意圖,五、質(zhì)粒DNA的純化,2020/9/21,39,過量EB處理前，細(xì)菌染色體DNA與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒DNA的密度均為1.7g/cm3左右，難以區(qū)分。經(jīng)過量EB處理后，不同分子構(gòu)型的DNA與EB的結(jié)合能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。 閉環(huán)質(zhì)粒DNA為超螺旋三級結(jié)構(gòu)，EB不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，約為1.59 g/cm3。 染色體DNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA以及帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降較多，約為1.54 g/cm3。,2020/9/21,40,2020/9/21,41,（四）DNA片段的回收,無論采用何種方法從何種支持介質(zhì)中回收DNA片段，都要

15、注意兩個原則，一是要提高DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA樣品中的污染。,2020/9/21,42,DNA的回收率與DNA片段的大小有一定關(guān)系，隨著分子量的增大，回收率明顯下降，大于20kb時，回收率低于20%。 DNA片段的含量與回收率也有密切關(guān)系，量越少回收率越低，若DNA片段量小于500ng時，幾乎很難回收。因此回收DNA片段時，要正確選擇回收方法，并要注意提高DNA上樣量，減少DNA回收時的洗脫體積以達(dá)到提高回收率的目的。,2020/9/21,43,1. 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段 主要包括二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素膜插片電泳法、電泳洗脫法、冷凍擠壓法及低熔點瓊脂糖凝膠挖

16、塊回收法等。,2020/9/21,44,（1）DEAE纖維素膜插片電泳法 DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以結(jié)合帶負(fù)電荷的DNA分子。將DEAE纖維素膜插入到經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的核酸條帶前，繼續(xù)電泳直至所需回收的DNA片段剛好轉(zhuǎn)移到膜上。取出DEAE纖維素膜，低鹽條件下洗去雜質(zhì)，高鹽條件下洗出DNA分子。,2020/9/21,45,該法操作比較簡單，可同時回收多個DNA片段，對500bp5kb的DNA片段回收率好，純度高，能滿足大多數(shù)實驗的要求。 DNA片段大于5kb時，因結(jié)合力增大而回收率下降。至10kb或為單鏈DNA時，其與膜的結(jié)合變得很牢固而難以回收。因此，本法不適合于分子量大于10

17、kb的DNA片段的回收，也不能回收單鏈DNA。,2020/9/21,46,（2）電泳洗脫法 包括兩個主要步驟，一是將待回收的DNA片段電泳出凝膠介質(zhì)，使其進(jìn)入一個便于回收的小容積溶液中；二是分離純化出DNA片段。 按是否使用透析袋可分為透析袋電泳洗脫法與非透析袋電泳洗脫法兩大類。,2020/9/21,47,透析袋電泳洗脫法需要切下含待回收DNA片段的凝膠條，然后放入透析袋內(nèi)進(jìn)行電泳，使DNA分子遷移出凝膠條進(jìn)入透析袋的溶液中，最后經(jīng)抽提純化回收DNA分子。 該法操作很不方便而且不適合于同時回收大量不同的DNA片段，但可有效回收從200bp至大于50kb的DNA，尤其對大于5kb的DNA有良好的

18、回收率。,2020/9/21,48,（3）低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法 是從低熔點瓊脂糖凝膠中切出含待回收DNA的凝膠塊，利用其純度高、熔點低（65）及凝固溫度低（30）的特點，在室溫大于30，瓊脂糖仍為液態(tài)的情況下，對DNA片段進(jìn)行回收的方法。 回收片段的純化方案，可分為有機試劑提取法、玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法和瓊脂水解酶（agarase）法。,2020/9/21,49,有機試劑法以酚、氯仿抽提DNA，可以有效回收0.5kb5kb的DNA片段。 玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法是將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液或高氯酸鈉溶液中，然后加入玻璃珠（或玻璃粉）以結(jié)合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在低鹽緩沖液中將

19、DNA洗脫下來。玻璃珠（或玻璃粉）洗脫法較有機試劑提取法快，但回收率略低。 瓊脂水解酶法對切下的含DNA的凝膠塊進(jìn)行消化，將瓊脂糖水解為二糖，釋放的DNA用酚抽提，乙醇沉淀回收。,2020/9/21,50,2. 從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段 從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。即將含待回收DNA條帶的凝膠塊切出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖液浸泡，使DNA洗脫出來。 能很好回收小于1kb的單鏈或者雙鏈DNA，且純度很高，無酶抑制劑，也無對轉(zhuǎn)染細(xì)胞或微注射細(xì)胞有毒的污染物，雖費時但操作簡單，是小片段DNA回收的較好方法。依分子量不同，其回收率從小于30%至大于90

20、%不等。,（五）RNA的分離純化,2020/9/21,52,1. RNA制備的條件與環(huán)境 為防止RNase對RNA 的水解 全力避免細(xì)胞外RNase的污染并抑制其活性 盡快抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性并極力地去除RNase。,2020/9/21,53,從RNA提取的初始階段開始，就選擇性地使用針對RNase的蛋白質(zhì)變性劑、蛋白的水解酶和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑并聯(lián)合使用RNase的特異性抑制劑（如DEPC）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的水解。 在變性液中加入-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以破壞RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。,2020/9/21,

21、54,DEPC（焦碳酸二乙酯） 高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。,O,C-CH2-CH3,O,C-CH2-CH3,O,=,=,DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處理1h，并高壓滅菌15min。 玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處理1h或室溫下過夜。,DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC。,2020/9/21,55,2. 總RNA的分離與純化,創(chuàng)造無RNA酶環(huán)境的工作主要包括兩個方面：極力避免外源RNase的污染和盡力抑制內(nèi)源性RNase的活力。 前者主

22、要來源于操作者的手、實驗的器皿和試劑；后者主要來源于樣品中的組織細(xì)胞。,2020/9/21,56,避免外源性RNase污染的措施主要是用0.1%的DEPC處理所用試劑和玻璃器皿，塑料器材最好使用滅菌的一次性用品，實驗人員在操作過程中應(yīng)戴口罩和手套，在超凈工作臺內(nèi)完成提取過程等。,2020/9/21,57,抑制內(nèi)源性RNase的活性主要是盡可能早的去除細(xì)胞內(nèi)蛋白，加入RNase抑制劑。在-巰基乙醇的協(xié)同作用下，高濃度的（異）硫氰酸胍可以極大極快地抑制RNase的活性，能從胰腺等富含RNase的組織細(xì)胞中分離出完整的RNA分子，目前已成為常規(guī)使用的試劑。,2020/9/21,58,（1）（異）硫氰

23、酸胍-酚氯仿一步法 是經(jīng)典的一步法。以含4mmol/L的（異）硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰基乙醇的變性溶液裂解細(xì)胞，然后在pH4.0的酸性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來制備RNA。 主要用于從培養(yǎng)細(xì)胞和大多數(shù)動物組織中分離純化總RNA。,2020/9/21,59,（2）可同時制備RNA、DNA與蛋白質(zhì)的一步法 以（異）硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞，然后加入氯仿后形成兩相。變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面，保留于上層水相的RNA在RNA沉淀溶液中通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌進(jìn)行制備。,2020/9/21,60,該法制備的RNA樣品極少有多

24、糖與蛋白多糖的污染，可用于mRNA的純化、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR反應(yīng)等。 處于界面的DNA與蛋白質(zhì)可通過乙醇和異丙醇分別分級沉淀出來。該法制備的DNA，大小約為20kb，可作PCR反應(yīng)的模板，蛋白質(zhì)樣品則主要用于免疫印跡。,2020/9/21,61,3. mRNA的分離與純化 （1）oligo(dT)-纖維素柱層析法 它是以oligo(dT)-纖維素填充層析柱，加入待分離的總RNA樣品，其中poly(A)+RNA在高鹽條件下，通過堿基互補，與oligo(dT)-纖維素形成穩(wěn)定的RNA-DNA雜交體，洗去未結(jié)合的其它RNA，然后在低鹽緩沖液中洗脫并回收poly(A)+RNA。

25、,2020/9/21,62,從哺乳動物細(xì)胞提取大量的非放射性RNA 時，oligo(dT)-纖維素柱層析法是首選方法，回收的poly(A)+RNA量可達(dá)總RNA的1%10%。但該法分離速度慢，易阻塞，不適合同時對多個標(biāo)本的處理，而且很難回收全部的poly(A)+RNA，故不適合對少量RNA樣品的分離。,2020/9/21,63,（2）oligo(dT)-纖維素液相結(jié)合離心法 原理與oligo(dT)-纖維素柱層析法完全相同，只是不經(jīng)填柱，而是直接將oligo(dT)-纖維素加入到一系列含不同RNA樣品的微量離心管中，通過離心收集吸附有poly(A)+RNA的oligo(dT)-纖維素，經(jīng)漂洗后

26、，用含70%的乙醇洗脫液將吸附的poly(A)+RNA從oligo(dT)-纖維素上洗脫并沉淀出來。,2020/9/21,64,該法可同時批量處理多個樣品，而且能從少量的RNA樣品中分離出poly(A)+RNA。用本法分離poly(A)+RNA時，應(yīng)選用等級較高的oligo(dT)-纖維素，如oligo(dT)18-30纖維素，而一般的柱層析填充的是oligo(dT)12-18纖維素。,2020/9/21,65,（3）磁珠分離法 是利用oligo(dT)與poly(A)互補配對的特性，用生物素標(biāo)記oligo(dT)，通過它與mRNA3末端poly(A)的退火形成雜交體，然后用標(biāo)有親和素的順磁球

27、珠和磁性分離架捕獲并洗滌生物素oligo(dT)/mRNA雜交體，最后用無RNase的去離子水將之洗脫下來，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。,2020/9/21,66,磁珠分離法純化poly(A) +RNA的原理,2020/9/21,67,該方法可對poly(A)+RNA進(jìn)行高效、靈敏、快速的分離。其產(chǎn)量甚至比常規(guī)的oligo(dT)-纖維素柱層析法還高，且分離的poly(A)+RNA能用于幾乎所有的分子生物學(xué)實驗。但它對組織或細(xì)胞的最大處理量每次不超過1克，而且磁珠很貴并需要專門的磁性分離架。,2020/9/21,68,四、核酸的濃縮、沉淀與洗滌,沉淀是核酸濃縮最常用的方法，其優(yōu)點在于核

28、酸沉淀后，可以很容易地改變?nèi)芙饩彌_液和調(diào)整核酸溶液至所需濃度；另外，核酸沉淀還能去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子，有一定的純化作用。 加入一定濃度的鹽類后，用有機溶劑沉淀核酸。其中常用的鹽類有醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉及氯化鎂等，常用的有機溶劑則有乙醇、異丙醇和聚乙二醇。,2020/9/21,69,核酸沉淀往往含有少量共沉淀的鹽，需用70%75%的乙醇洗滌去除。對于濃度低并且體積較大的核酸樣品，可在有機溶劑沉淀前，采用固體的聚乙二醇或丁醇對其進(jìn)行濃縮處理。,2020/9/21,70,五、核酸的鑒定和保存,（一）核酸的鑒定 1濃度鑒定 （1）紫外分光光度法 OD260=1.0相當(dāng)于 50g/ml雙鏈

29、DNA 40g/ml單鏈DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸,2020/9/21,71,紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。 如計算DNA濃度 A260稀釋倍數(shù)50 g/ml,(A值等于1時，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20 g/ml單鏈寡核苷酸）,這種方法只用于測定濃度大于0.25g/ml的核酸溶液。,2020/9/21,72,（2）熒光光度法 核酸的熒光染料溴化乙錠（EB）嵌入核酸分子的堿基平面后，使本身無熒光的核酸在紫外線激發(fā)下發(fā)出橙紅色的熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。該法靈敏度可達(dá)1ng5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。,

30、2020/9/21,73,EB與DNA的結(jié)合,2020/9/21,74,2純度鑒定 （1）紫外分光光度法 主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。 在TE緩沖液中，純DNA樣品A260/A280比值為1.8，純RNA樣品A260/A280比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。 蛋白質(zhì)與核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm與酚在270nm的高吸收峰可以鑒別主要是蛋白質(zhì)的污染還是酚的污染。,2020/9/21,75,RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8，故比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液，可能兼有蛋白質(zhì)、酚與RNA的污染，需結(jié)合其它方法加以鑒定。 A260/A280的比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的一個良好指標(biāo)，2.0是高質(zhì)量RNA的標(biāo)志。但要注意，由于受RNA二級結(jié)構(gòu)不同的影響，其讀數(shù)可能會有一些波動，一般在1.82.1之間都是可以接受的。,2020/9/21,76,（2）熒光光度法 用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。 由于DNA分子較RNA大許多，電泳遷移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%85%，tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%20%，mRNA占1%5%。故總RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。,2020/9/21,77,在原核生物