1、藥品分析方法建立及驗(yàn)證 從質(zhì)量控制出發(fā),目錄,方法考慮原則,預(yù)期的監(jiān)督機(jī)構(gòu)期望 產(chǎn)品質(zhì)量參數(shù)對安全性和有效性的預(yù)期影響 分子的具體開發(fā)經(jīng)驗(yàn) 來自之前以開發(fā)的類似分子的平臺經(jīng)驗(yàn),方法開發(fā)考慮,折疊結(jié)構(gòu)可以防止生物制品降解，但同時使分子的某些部分難以被檢測到 被結(jié)構(gòu)所保護(hù)的易受影響基團(tuán)延緩了降解過程（氧化、脫酰胺基、切斷和聚合） 完整結(jié)構(gòu)使得分析方法很難檢測到內(nèi)部的變化 在某些分析中保持三維結(jié)構(gòu)是很重要的（如SEC），但在其他一些分析中則需拆開折疊結(jié)構(gòu)（如變性凝膠電泳）,方法開發(fā)考慮,如何解釋不是針對完整分子而是針對裂解部分所進(jìn)行的檢測而獲得的數(shù)據(jù) 有時有必要將一個蛋白分子裂解為所需的片段，然后對

2、所關(guān)注的片段進(jìn)行分析，如用于蛋氨酸氧化測定肽圖 多數(shù)時候片段并非以簡單直接或線性的方式與完整分子相關(guān)聯(lián)（不再是1：1） 需要明確地確定完整分子的片段進(jìn)行分析而得到的某些參數(shù)的報告值,方法開發(fā)考慮,從不同正交試驗(yàn)或從主要和輔助試驗(yàn)所得的雜質(zhì)量并不是可以累加的 生物制品需要多項檢測來檢量其多種特性，如電荷、分子大小等 如果一個分子包含多種修飾，則它將被多次計算，但是降解的分子仍然只有一個 所以不同檢測所得到的值是不能累加的,方法開發(fā)考慮,對于所要分析的蛋白質(zhì)物種，通常無法獲得純的樣品 用來進(jìn)行加樣/回收的物質(zhì)是所要分析的蛋白質(zhì)物種（雜質(zhì)）的富集物，而不是純化物,很多時候，峰并不能達(dá)到基線分離 可容

3、許實(shí)驗(yàn)誤差較大 定量限較高,方法開發(fā)考慮,基質(zhì)（配方組成）或酸堿度變化、自由巰基的出現(xiàn)等，可能在分析過程中形成原來并不存在的雜質(zhì) 通過溶液交換消除基質(zhì)影響 減少暴露于過高或過低酸堿度溶液的時間 在某些特定方法中，自由巰基會導(dǎo)致分析方法造成的雜質(zhì) 這些都是要設(shè)法避免,方法開發(fā)考慮,1. 生物學(xué)活性：是反映生物技術(shù)藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)，通常使用細(xì)胞或動物進(jìn)行測定，誤差相對較大。不同批細(xì)胞、血清、或其它易變性物質(zhì)對測定方法的準(zhǔn)確度和精密性均有影響。 2. 生物技術(shù)藥物多為生物大分子藥物，具有分子量大、結(jié)構(gòu)多樣性和可變性等特點(diǎn)，結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化可影響藥物的活性和質(zhì)量。 3. 對酸、堿、高溫、凍融等不穩(wěn)定，

4、保存、運(yùn)輸條件不當(dāng)會影響藥品質(zhì)量，并可能導(dǎo)致方法轉(zhuǎn)移困難或失敗。 4. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：活性標(biāo)準(zhǔn)品、含量標(biāo)準(zhǔn)品、理化對照品，根據(jù)情況可能分別制備，保存、運(yùn)輸條件相對較高，需對其穩(wěn)定性進(jìn)行認(rèn)真分析與評價。,方法哪里來,標(biāo)準(zhǔn)方法（或正式方法、法定方法） 一般是指已有國家標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控方法，WHO 推薦的質(zhì)控方法也可作為重要參考。此類方法在被確定為標(biāo)準(zhǔn)方法前已經(jīng)過了適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。申報者應(yīng)說明方法的來源，并附具體方法。研制單位在首次采用此類方法前，也應(yīng)對該方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿?yàn)證，如進(jìn)行專屬性和精密度的驗(yàn)證，以便證明在實(shí)際的使用條件下該方法也是適用的。 標(biāo)準(zhǔn)方法的替代方法 此類方法系指由申報者提出的可取代標(biāo)準(zhǔn)方法的替代

5、方法。申報者在決定采用此類方法時應(yīng)持慎重的態(tài)度，并需提供表明新方法等同于或優(yōu)于原方法的依據(jù)以及全面的驗(yàn)證資料，包括兩種方法的比較性資料。,來自參考文獻(xiàn)的方法 是指在專業(yè)雜志或著作上發(fā)表并介紹的方法，一般要認(rèn)真對待此類方法，并需進(jìn)行全面的驗(yàn)證。應(yīng)說明參考文獻(xiàn)的出處，附原文及譯文。 自己建立的方法 對于某些產(chǎn)品，尤其是創(chuàng)新性產(chǎn)品來講，由于缺少可參考的方法，通常需要自己建立一種新的分析方法，對于這類方法需進(jìn)行全面而嚴(yán)格的驗(yàn)證。,開發(fā)什么方法,適用于所有分子的方法 蛋白濃度或含量 紫外/可見光光度法（基于消光系數(shù)，靈敏度低，干擾物多） 高效液相色譜法（基于標(biāo)準(zhǔn)樣校正） BCA/TCA/G250（基于標(biāo)

6、準(zhǔn)樣校正，基質(zhì)有可能干擾) 電荷概括 離子交換色譜（原始狀態(tài)） 毛細(xì)管等電聚焦法（原始狀態(tài)和局部變性狀態(tài)）,開發(fā)什么方法,適用于所有分子的方法 分子大小概況 SEC（原始狀態(tài)） 凝膠電泳法（非折疊（變性）狀態(tài)） 病毒樣顆粒概況 電鏡（局部原始狀態(tài)，人為影響因素大） DLS（原始狀態(tài)，分辨率差，大小精準(zhǔn)） SEC（原始狀態(tài)，流動相會影響蛋白狀態(tài)）,開發(fā)什么方法,適用于所有分子的方法 雜質(zhì)殘留量 HPLC（基于標(biāo)準(zhǔn)樣校正或自身對照） GC（對殘留溶劑） ICP/AAS （對元素測定） Elisa （宿主蛋白、雜蛋白測定） Southern Blot/熒光光譜 （殘留DNA）,開發(fā)什么方法,適用于特

7、定分子的方法 分子鑒定 肽圖 （純度較高） Western Blot （使用范圍廣） 紫外掃描圖 （純度及基質(zhì)要求高） 氨基酸測序 (純度及基質(zhì)要求高，樣品末端無封閉） 偶聯(lián)密度 ADC （抗體藥物偶聯(lián)物） 抗原與載體蛋白偶聯(lián)物（疫苗類藥物） 結(jié)合力 抗原與佐劑相互作用,開發(fā)什么方法,適用于特定分子的方法 活性測定 Elisa（體外評價） 動物實(shí)驗(yàn) （體內(nèi)評價） 中和實(shí)驗(yàn) （細(xì)胞測定特定表位） 降解物測定 HPLC/MS（基于標(biāo)準(zhǔn)樣校正或自身對照） 凝膠電泳 （基于特異分子帶） SEC/熒光光譜 （解聚或聚合）,開發(fā)什么方法,檢測方法初識電泳及毛細(xì)管電泳,檢測方法初識SEC,檢測方法初識DAD

8、光譜,檢測方法初識熒光光譜,檢測方法初識HPLC肽圖,檢測方法初識UV Cp-Temp,檢測方法初識HPLC肽圖,睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF),檢測方法初識ESI-MS,分析方法驗(yàn)證法規(guī)要求,資料6.質(zhì)量研究資料，臨床前有效性及安全性研究資料 （1）質(zhì)量研究及注冊標(biāo)準(zhǔn)研究資料； （2）檢定方法的研究以及驗(yàn)證資料； （3）與同類制品比較研究資料； （4）產(chǎn)品抗原性、免疫原性和動物試驗(yàn)保護(hù)性的分析資料； （5）動物過敏試驗(yàn)研究資料； （6）動物安全性評價資料。,分析方法驗(yàn)證法規(guī)要求,1.6探索性研究及其檢驗(yàn)結(jié)果分析 1.6.1開展探索性研究項

9、目及其目的。敘述開展探索性研究的項目，研究目的，采用的主要方法。 1.6.2探索性研究及其檢驗(yàn)結(jié)果分析。逐項敘述探索性研究項目詳細(xì)研究方法，樣品與對照品的典型圖譜或照片，研究結(jié)果與結(jié)論。 該項目的方法學(xué)按中國藥典附錄驗(yàn)證，詳細(xì)方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容在附件中列出。,分析方法驗(yàn)證法規(guī)要求,分析方法驗(yàn)證法規(guī)要求,分析方法驗(yàn)證法規(guī)要求,第十二條 質(zhì)量控制的基本要求： （四）檢驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗(yàn)證或確認(rèn)；,第二百二十三條 物料和不同生產(chǎn)階段產(chǎn)品的檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求： （二）符合下列情形之一的，應(yīng)當(dāng)對檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證： 1.采用新的檢驗(yàn)方法； 2.檢驗(yàn)方法需變更的； 3.采用中華人民共和國藥典及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未

10、收載的檢驗(yàn)方法； 4.法規(guī)規(guī)定的其他需要驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法。 （三）對不需要進(jìn)行驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法，企業(yè)應(yīng)當(dāng)對檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn)，以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠；,分析方法驗(yàn)證驗(yàn)證項目,限度、鑒定等定性或半定量試驗(yàn)，無標(biāo)準(zhǔn)曲線，不作精密度、準(zhǔn)確度要求。,分析方法驗(yàn)證驗(yàn)證項目,I類方法：制劑中原料藥或活性成分（包括防腐劑）的定量分析方法； II類方法：原料藥中雜質(zhì)或制劑中降解化合物的分析方法；包括定量方法和限度檢查； III類方法：藥物性能特征分析方法：溶出，藥物釋放 IV類方法：鑒別實(shí)驗(yàn),分析方法驗(yàn)證驗(yàn)證項目,定義：指一種方法在有可能的干擾物質(zhì)（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物和基質(zhì)）存在時，能夠準(zhǔn)確無誤地評估被分析物的能力

11、,分析方法驗(yàn)證專屬性,鑒別:確?？梢澡b別被分析物 純度檢查：確保所有的分析過程能夠?yàn)殡s質(zhì)的含量提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，如相關(guān)物質(zhì)檢查、重金屬限度檢查、有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)檢查等 含量測定：提供準(zhǔn)確的檢測結(jié)果以保證含量樣品中被分析物的含量或效價值準(zhǔn)確無誤,在其他成分（雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的分析方法能夠正確測定被測物的能力。作為分析方法的成立基礎(chǔ)。,一般采用相似物、不含API空白樣品作為陰性對照，以標(biāo)準(zhǔn)品或經(jīng)認(rèn)可樣品作為陽性對照。,如采用免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行生物制品的鑒別，應(yīng)首先對所使用抗體的特異性進(jìn)行分析；若供試品中還存在其它組分，則應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證被檢測物中其它物質(zhì)能否引起非特異性免疫反應(yīng)。,例如：

12、,如采用細(xì)胞測定方法檢測生物活性，應(yīng)首先說明被測物質(zhì)與特定的細(xì)胞應(yīng)答之間的相關(guān)性，如二者的相關(guān)性較好，則一般認(rèn)為該方法的特異性較好。為表明細(xì)胞測定方法的特異性，可進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，如加入抗體或特異抑制劑的封閉實(shí)驗(yàn)等。如果成品中加入了可能影響活性測定的輔料，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證以排除此種影響。,如采用ELISA法檢測重組產(chǎn)品的殘余宿主蛋白含量，可采用與表達(dá)體系相同的宿主細(xì)胞的蛋白作為免疫原制備抗體，若采用與產(chǎn)品相似工藝進(jìn)行處理后再免疫動物，則所獲得抗體的特異性更好。另外，產(chǎn)品中存在的大量目的蛋白可能影響殘余宿主蛋白的測定，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證以排除此種影響。,分析方法驗(yàn)證專屬性,定性分析（鑒別）：樣品陽

13、性結(jié)果空白陰性結(jié)果結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的陰性結(jié)果；,分析方法驗(yàn)證專屬性,雜質(zhì)檢查（對照品可得）：將可能的雜質(zhì)對照品加入樣品中； 雜質(zhì)檢查（對照品不可得）： 用另外一種官方的標(biāo)準(zhǔn)或經(jīng)驗(yàn)證的方法對樣品和經(jīng)降解的樣品分析，比較兩種方法得到的雜質(zhì)概況 使用其他技術(shù)對峰純度進(jìn)行檢查，如二極管陣列檢測器、MS等,含量測定：被分析物與其他干擾峰完成分離。向樣品中加入一定量的干擾物，含量測定的結(jié)果不受干擾；檢查主峰的純度,鑒別：采用與被測物結(jié)構(gòu)類似的化合物以及被測物分別進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。被測物為正反應(yīng)。被測物結(jié)構(gòu)類似的化合物為負(fù)反應(yīng)。測物結(jié)構(gòu)類似的化合物可選用中間體、副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物等。,定義：對均一樣品重復(fù)取樣檢測每個

14、檢測結(jié)果間的接近程度，RSD%,CV%,分析方法驗(yàn)證精密度,重復(fù)性repeatability：短時間內(nèi)同一分析人員使用同一儀器 中間精密度intermediate precision:在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的變化，如不同分析時間、不同分析人員、不同分析儀器 重現(xiàn)性reproducibility:在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重復(fù),方法 100濃度6次 3濃度3次,定義：方法的檢測結(jié)果與真實(shí)值的接近程度。,分析方法驗(yàn)證準(zhǔn)確度,方法： 原料藥：分析已知含量的對照品；第二種確定的方法分析，結(jié)果比較 制劑：加樣回收；第二種確定的方法分析，結(jié)果比較 應(yīng)在方法的范圍內(nèi) 計算回收率：3濃度3次,分析方法驗(yàn)證精密度與準(zhǔn)確度,定義：在

15、聲明的實(shí)驗(yàn)條件下所能檢測到的被分析物的最小量。限度檢查的指標(biāo)；表示為在樣品中的濃度, ppm,分析方法驗(yàn)證檢測限,方法： 檢測已知濃度的樣品(對照品) 雜質(zhì)的DL0.05% 信噪比2:1/3:1,分析方法驗(yàn)證定量限,定義：在聲明的實(shí)驗(yàn)條件下被分析物可被定量分析并能滿足合格的精密度和準(zhǔn)確度的最小值。微量物質(zhì)的定量分析：有關(guān)物質(zhì)定量分析，有機(jī)揮發(fā)性物質(zhì)的定量分析。，ppm,方法： 已知濃度樣品（對照品） 相關(guān)物質(zhì)0.05 證明精密度和準(zhǔn)確度 信噪比10:1,分析方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍,標(biāo)準(zhǔn)曲線：一定濃度范圍內(nèi)，儀器對分析物的響應(yīng)，可通過一定濃度的分析物（或內(nèi)標(biāo)物）與被分析物比較，計算其含量。,

16、基質(zhì)應(yīng)盡可能保持與樣品一致，但不應(yīng)參與樣品前處理工序。因?yàn)闃悠非疤幚砉ば蛑?，可能有不同程度的損失。,若在任何轉(zhuǎn)換后均不能證明呈線性，或呈線性關(guān)系的范圍較小，可以采用曲線擬合方法，通過測定全范圍曲線，在標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的矯正下，依ED50或IC50值計算活性單位。應(yīng)提供擬合曲線方程及各參數(shù)，并提供相關(guān)系數(shù)。,線性范圍：在適當(dāng)?shù)木芏取?zhǔn)確度和線性基礎(chǔ)上檢測到的被分析物的最低水平到最高水平區(qū)間,分析方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍,一定范圍內(nèi)的不同濃度點(diǎn)進(jìn)樣，繪制響應(yīng)值（y）與濃度(x)之間的回歸線，計算回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r,r2）,主成分含量測定：80120檢測濃度 雜質(zhì)含量測定：定量限（50）120

17、標(biāo)準(zhǔn) 裝量差異：70130檢測值 溶出實(shí)驗(yàn)：20規(guī)定范圍,分析方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品吸收值為：1.314,測定值為：869.3g/ml,若標(biāo)準(zhǔn)曲線處理后，出現(xiàn)2%的損耗，則 測定值為：910.6g/ml,測定值為：4.75%,分析方法驗(yàn)證耐用性,定義：分析方法的某些參數(shù)發(fā)生微小變化時方法抗干擾的能力，表示在正常使用時的可靠性,方法：刻意改變參數(shù)，考察結(jié)果的變化 流動相的pH值、流動相的組成（極性的變化）、 不同供應(yīng)商柱子、柱溫、流速等,液相：評估柱溫、流速、色譜柱、緩沖鹽pH、有機(jī)相比例、流動相比例、溶液放置時間對檢測結(jié)果的影響 氣相：評估柱溫、流速、色譜柱、溶液放置時間對檢測結(jié)果的影響,分析

18、方法驗(yàn)證SEC,基本要求確定 無標(biāo)準(zhǔn)品，假設(shè)單體、聚合物或VLP在214nm/280nm響應(yīng)因子基本相同，以峰面積百分比代表重量百分比 有標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品，測定各自響應(yīng)因子，以校正峰面積百分比代表重量百分比 對于蛋白樣品而言，214nm肽鍵特異波長段響應(yīng)值高，280nm為蛋白特異波長段響應(yīng)值低。通常以280nm作為檢測波長。 要求能夠?qū)悠凡煌奂⒔Y(jié)合狀態(tài)進(jìn)行分離。,分析方法驗(yàn)證SEC,系統(tǒng)精密度 將加入了5%聚合物的單個樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，計算6次進(jìn)樣的聚合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值,方法精密度和中間精密度 使用分別由兩位分析人員制備的加入了濃度為2.5%、5.0% 和7.5%聚合物

19、的各三份重復(fù)樣品(總共18份配制液) 方法精密度是三份重復(fù)樣品的最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值 中間精密度是所有樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值,分析方法驗(yàn)證SEC,線性及范圍 使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5% 和9.0%聚合物的樣品 計算聚合物%與聚合物峰面積的線性回歸,準(zhǔn)確度 使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5% 和9.0%聚合物的樣品 根據(jù)高純度單體樣品中的單體和聚合物含量、聚合物富集樣品中的單體和聚合物含量以及加樣中所用的體積來計算加樣樣品中的理論預(yù)期聚合物含量,分析方法驗(yàn)證SEC,紅線：藥源； 藍(lán)線：空白；黑線： 稀釋液,專屬性,分

20、析方法驗(yàn)證SEC,驗(yàn)證數(shù)據(jù),分析方法驗(yàn)證報告部分,第二百二十三條 物料和不同生產(chǎn)階段產(chǎn)品的檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求 （六）檢驗(yàn)記錄應(yīng)當(dāng)至少包括以下內(nèi)容 1.產(chǎn)品或物料的名稱、劑型、規(guī)格、批號或供貨批號，必要時注明供應(yīng)商和生產(chǎn)商（如不同）的名稱或來源； 2.依據(jù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)操作規(guī)程； 3.檢驗(yàn)所用的儀器或設(shè)備的型號和編號； 4.檢驗(yàn)所用的試液和培養(yǎng)基的配制批號、對照品或標(biāo)準(zhǔn)品的來源和批號； 5.檢驗(yàn)所用動物的相關(guān)信息； 6.檢驗(yàn)過程，包括對照品溶液的配制、各項具體的檢驗(yàn)操作、必要的環(huán)境溫濕度； 7.檢驗(yàn)結(jié)果，包括觀察情況、計算和圖譜或曲線圖，以及依據(jù)的檢驗(yàn)報告編號； 8.檢驗(yàn)日期； 9.檢驗(yàn)人員的簽名和日期； 10.檢驗(yàn)、計算復(fù)核人員的簽名和日期。 （七）所有中間控制（包括生產(chǎn)人員所進(jìn)行的中間控制），均應(yīng)當(dāng)按照經(jīng)質(zhì)量管理部門批準(zhǔn)的方法進(jìn)行，檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)有記錄； （八）應(yīng)當(dāng)對實(shí)驗(yàn)室容量分析用玻璃儀器、試劑、試液、對照品以及培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量檢查；,分析方法確認(rèn)適用范圍,適用于藥典方