1、蛋白酶活性的測定方法及原理,羅老師,組員,寧舒婷,陳麗君,陳海梅,王熙棟,各種測定方法及原理,考馬斯亮藍(lán)法,甲醛滴定法,DHT-酪蛋白法,DNA-溴乙錠熒光分析法,X-光膠片法,福林酚法,甲醛滴定法,3,考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)在酸性條件下結(jié)合，主要是染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色，在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。,考馬斯亮藍(lán)法,4,蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，從而測定其酶活。,

2、考馬斯亮藍(lán)法,甲醛滴定法,5,用5-氨基四唑重氮鹽將氨基酸中部分組氨酸和酪氨酸重氮化，得到黃色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白為底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二價離子可與DHT-蛋白與DHT-肽形成穩(wěn)定的可溶性紅色螯合物，而鋅離子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。選用合適濃度的鋅離子和鎳離子作為沉淀劑和顯色劑，利用比色法可測定蛋白酶酶活。,考馬斯亮藍(lán)法,DHT-酪蛋白法,6,溴乙錠插入雙鏈DNA的堿基對之間時，可使DNA的熒光增加25倍。接近飽和的溴乙錠(0.5g/mL) 與DNA 混合時，其熒光增加量與DNA的濃度呈正比。在DNA-組蛋白-

3、溴乙錠溶液中加入蛋白酶時，蛋白酶水解結(jié)合在DNA鏈上的組蛋白，使DNA 結(jié)合部位暴露出來，溴乙錠重新插入DNA雙鏈中，熒光增加量與蛋白酶活性呈正比。通過測定DNA溶液的熒光增量來計算蛋白酶的活性。,考馬斯亮藍(lán)法,DNA-溴乙錠熒光分析法,7,酶的底物明膠涂抹在X-光膠片上，當(dāng)待測酶液滴加到X-光膠片上時，酶將X-光膠片上的明膠水解，用水沖洗膠片，即可看到膠片上明膠被酶水解的地方，出現(xiàn)透明的圓圈。酶活性的高低與透明圓圈的面積成正比。測定圓圈的面積以測定蛋白酶的活性。,考馬斯亮藍(lán)法,X-光膠片法,8,福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物，而蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸如

4、酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)，利用此原理測定蛋白酶酶活。,考馬斯亮藍(lán)法,福林酚法,福林酚法測定蛋白酶活性,蛋白酶對酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鎢蘭和鎢蘭混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來間接測定蛋白酶的活力。,分析天平：精度0.0001g 恒溫水?。壕?.2 計時表 分光光度計 沸水浴器 振蕩混合器 pH計: 精度0.01pH單位

5、乳酸緩沖液（pH=3.0）適用于酸性蛋白酶 磷酸緩沖液（pH=7.5）適用于中性蛋白酶 硼酸緩沖液 (pH=10.5) 適用于堿性蛋白酶 0.4mol/L碳酸鈉溶液 0.4mol/L的三氯醋酸液 0.5mol/L的NaOH 10.00mg/ml酪素溶液 100g/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按下表配制,分別取上述溶液各1.00ml(須做平行試驗)，各加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml。福林試劑使用溶液1.00ml,置于40+0.2水浴中顯色20min,取出用分光光度計于波長680nm,比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點，分別測定其吸光度值，以吸光度值為縱坐

6、標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算回歸方程。計算出當(dāng)OD為1時的酪氨酸的量（g），即為吸光常數(shù)K值，其K值應(yīng)在95100范圍內(nèi)。,實驗步驟,蛋白酶活性的計算,K：吸光常數(shù),Title,1g固體酶粉（或1ml液體酶），在40（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1g酪氨酸為一個酶活力單位。,蛋白酶的活力= AK4/10n U/g(ml),A：樣品平行試驗的平均OD值,K：吸光常數(shù),4：反應(yīng)試劑的總體積 0：酶解反應(yīng)時間 n：酶液稀釋總倍數(shù),1,思考題,Title,蛋白酶有哪幾類？ 按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵

7、，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白質(zhì)或多肽的酰胺鍵。 按酶的來源可分為：動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶 微生物蛋白酶又可分為：細(xì)菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白酶 按蛋白酶作用的最適PH可以分為（A）PH2.55.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.510.5的堿性蛋白酶，（C）PH78的中性蛋白酶,影響酶活力的因素有哪些？ 酶濃度對酶活力的影響：酶促反應(yīng)速率與酶分子的濃度呈正比，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。 底物濃度對酶活力的影響：若

8、酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時，酶促反應(yīng)速度與底物濃度呈正比，即隨底物濃度的增加而增加。當(dāng) 所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促反應(yīng)速度也不會增加。 溫度對酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而增加，超過最適反應(yīng)溫度，酶活力將會下降。 PH對酶活力的影響：酶在最適PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適PH，都會降低酶活性。 激活劑對酶活力的影響：某些無機(jī)陽離子、陰離子、有機(jī)化合物可作為激活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性。 抑制劑對酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力，它可降低酶促反應(yīng)速度。,使用紫外分光光度計時應(yīng)注意哪些問題？ 使用的比色皿必須潔凈，并注意配對使用。手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝盛樣品量以