1、名校名 推薦2012 高三生物總復(fù)習(xí)教案第 45 講 dna和蛋白質(zhì)技術(shù)教學(xué)案【考綱要求】生物技術(shù)在其它方面的應(yīng)用考綱要求具體內(nèi)容(3)pcr技術(shù)的基本操作和應(yīng)用(4) 蛋白質(zhì)的提取和分離實(shí)驗(yàn)內(nèi)容(3) 血紅蛋白的提取和分離操作實(shí)驗(yàn)與探究能力【考點(diǎn)分析】考點(diǎn)試卷類型題型pcr技術(shù)的基本操作和應(yīng)用2008 江蘇生物非選擇題2009江蘇生物選擇題【考點(diǎn)預(yù)測】從近幾年高考試題看，有關(guān)植物的組織培養(yǎng)內(nèi)容是命題的重點(diǎn)。預(yù)測今年高考命題可能會從下面兩個方面展開：1植物組織培養(yǎng)和花藥離體培養(yǎng)的原理、方法、操作步驟、注意事項等2pcr技術(shù)的基本操作和應(yīng)用3 蛋白質(zhì)的提取和分離原理、過程及其注意事項從近幾年新課

2、標(biāo)改革地區(qū)生物試題看，主要考查植物組織堵喬的原埋、近程及影響因素，以非選擇題為主。由于近兩年考查面的增加，賦分也有所增加的趨勢。以07 年到 08 年逐漸增多。命題角度的最大變化應(yīng)該是以過程圖和表格形式等多種表達(dá)形式考查學(xué)生對知識的掌握程度和識圖能力?？傮w上來說本單元的考查難度較低，且作為選做題出現(xiàn)為主。在復(fù)習(xí)的過程中，要多加強(qiáng)識記，同時注意實(shí)驗(yàn)探究能力的培養(yǎng)?！局R梳理】一、 dna的粗體取與鑒定1、 提取 dna的方法2、 dna的鑒定3、 設(shè)計實(shí)驗(yàn)過程二、 dna體外擴(kuò)增技術(shù)1、 pcr原理- 1 -名校名 推薦2、 pcr的反應(yīng)過程3、 dna含量的鑒定三、血紅蛋白的提取和分離【重點(diǎn)解

3、析】一、 dna的粗提取和鑒定1 dna的理化性質(zhì)(1)dna的溶解性dna和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的nacl 溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使dna充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。此外，dna不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些成分如蛋白質(zhì)等卻溶于酒精，利用這一原理，可將dna 與蛋白質(zhì)等進(jìn)一步地分離。(2)dna對酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對 dna沒有影響。 大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60 80的高溫，而 dna在 80以上時才會變性，洗滌劑能夠溶解細(xì)胞膜，但對dna沒有影響。(3)dna的熱變性dna分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，在解

4、旋酶的作用下使氫鍵斷裂，而在體外， dna在 80l00 的溫度范圍內(nèi)變性，即雙螺旋解開，成為單鏈；當(dāng)溫度慢慢降低后，兩條彼此分離的單鏈又會重新結(jié)合形成雙鏈。但高溫能使dna聚合酶變性失活，后來發(fā)現(xiàn)了耐高溫的taqdna聚合酶，解決了上述矛盾。2 基本原理(1)dna在不同濃度的nacl 溶液中的溶解度不同，在014 mol l 的 nacl 溶液中的溶解度最低，如下表所示由上表可以看出，在nacl 溶液物質(zhì)的量濃度為2 mo1 l 時， dna溶解，部分蛋白質(zhì)發(fā)生- 2 -名校名 推薦鹽析而生成沉淀，通過過濾可除去部分蛋白質(zhì)；在nacl 溶液物質(zhì)的量濃度為014 m01 l時， dna析出，

5、過濾可除去溶解的部分蛋白質(zhì)。(2)dna不溶于酒精溶液加入體積分?jǐn)?shù)為95的冷卻酒精溶液可使dna析出，除去溶于酒精的蛋白質(zhì)。(3)dna不被蛋白酶所水解嫩肉粉中含木瓜蛋白酶，加入嫩肉粉可使蛋白質(zhì)水解而dna不被水解。(4)dna 可被二苯胺染成藍(lán)色向含 dna的試管中加入二苯胺并沸水浴，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色可確認(rèn) dna。3 方法步驟(1) 實(shí)驗(yàn)材料的選擇首先選擇含有 dna的生物材料。選用 dna含量相對較高的生物組織，成功率較大。(2) 破碎細(xì)胞獲取含 dna的濾液動物細(xì)胞如雞血細(xì)胞在血細(xì)胞液中加入蒸餾水，用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。植物細(xì)胞用洗滌劑溶解細(xì)胞膜，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬脱心ィ^濾后收集

6、濾液。(3)去除濾液中的雜質(zhì)方案利用dna在不同濃度的nacl 溶液中溶解度不同，通過控制nacl 溶液的濃度去除雜質(zhì) ( 用 2 mol i 。 nacl 溶液過濾除去不溶的雜質(zhì)，用0 14 mol i 。 nacl 溶液析出dna，過濾，除去溶液中的雜質(zhì)，再用2 mol l nacl 溶液溶解dna)。方案在濾液中加入嫩肉粉，利用其蛋白酶水解蛋白質(zhì)。方案將濾液放入60 75恒溫水浴箱中保溫10 15 rain，使蛋白質(zhì)變性。(4)dna的析出與鑒定析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液等體積的冷卻酒精溶液( 體積分?jǐn)?shù)為95 ) 靜置，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物( 此即粗提取的dna)，用玻璃棒沿

7、一個方向攪拌卷起絲狀物。鑒定- 3 -名校名 推薦【例 1】關(guān)于“ dna的粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)裝置如圖(1)實(shí)驗(yàn)材料選用雞血細(xì)胞液，而不用雞全血。主要原因是雞血細(xì)胞液中含量較高。(2)在圖 a 所示的實(shí)驗(yàn)步驟中加蒸餾水20 ml 的目的是通過圖b 所示的步驟取得濾液，再在濾液中加入2mol/lnacl溶液 的 目 的 是 圖c 所 示 實(shí) 驗(yàn) 中 加 蒸 餾 水 的 目 的是。(3) 為鑒定實(shí)驗(yàn)所得絲狀物的主要成分是dna，可滴加溶液，結(jié)果絲狀物被染成綠色。解析： (1) 雞血細(xì)胞中含較多的dna，而血漿中不合dna，因此，實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)用雞血細(xì)胞液而不用雞全血。(2) 要明確區(qū)別兩次加蒸餾水的

8、目的，第一次目的是讓雞血細(xì)胞吸水漲破，放出dna，第二次加蒸餾水是為了降低nacl 溶液的濃度，使溶解于2 mol l_1 nacl溶液中的dna析出。(3) 本題考查dna的鑒定，可以加二苯胺沸水浴變藍(lán)色，也甲基綠使dna變綠色，本題干無沸水浴這一條件，且結(jié)果是絲狀物變綠色，所以使用的試劑為甲基綠。答案：(1)dna(2) 使血細(xì)胞吸水漲破，放出dna使濾液中的dna溶于鹽溶液使 dna析出(3) 甲基綠二、 pcr技術(shù)1生物體內(nèi)dna復(fù)制與 pcr反應(yīng)的區(qū)別- 4 -名校名 推薦體內(nèi) dna復(fù)制pcr 反應(yīng)，時期細(xì)胞有絲分裂間期或減數(shù)第體外隨時進(jìn)行一次分裂間期及無絲分裂、二分裂過程場所細(xì)胞

9、內(nèi)微量離心管內(nèi)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供加熱至 90，雙鏈全部解開，不需解旋能量，部分解開酶引物一小段 rna可以是 rna或單鏈 dna分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合合成，另一條鏈不連續(xù)合成成，控制溫度 72特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增dna聚合酶需 dna聚合酶需耐高溫的 taq dna聚合酶循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30 多次需提供 dna復(fù)制的模板相同點(diǎn)四種脫氧核苷酸作原料子鏈延伸的方向都是從5端到 3端2 pcr 技術(shù)擴(kuò)增dna片段(1) 原理： dna復(fù)制。(2】需要條件：模板dna、 rna引物、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定dn

10、a聚合酶 (taq 酶 ) 、離子。(3)方法： dna受熱變性解旋為單鏈、冷卻后rna引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、在dna聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈。(4) 特點(diǎn)：指數(shù)形式擴(kuò)增。(5) 過程：變性、復(fù)性、延伸、重復(fù)。步驟名稱需要溫度過程將反應(yīng)體系 ( 包括雙鏈模板、 引物、耐高溫的 dna聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等) 加熱第一步變性至90 95，使雙鏈 dna模板兩條鏈之間的氫鍵90 95打開，變成單鏈 dna，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板將反應(yīng)體系降溫至 55 60，使兩種引物分別與模板第二步復(fù)性55 60dna鏈 3端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對，這個過程稱為復(fù)性- 5 -名校

11、名 推薦將反應(yīng)體系升溫至 70 75，在耐高溫的 dna聚合酶第三步70 75催化作用下， 將與模板互補(bǔ)的單個核苷酸加到引物所提延伸合成供的 3 7一 oh上，使 dna鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的dna鏈。(6) 結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個 dna分子就變成了兩個 dna分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多， dna分子就以 2”的形式增加。 pcr的反應(yīng)過程都是在 pcr擴(kuò)增儀中完成的。【例 2】2008 年 5 月 20 日，民政部制訂汶川大地震遇難人員遺體處理意見時指出，無法確認(rèn)遇難者身份的，由公安部門提取可供dna 檢驗(yàn)的檢材以便后身份辨認(rèn)。事后的遺體辨認(rèn)可借助于 dna雜交技術(shù)， 即從遺

12、體細(xì)胞與死者家屬提供的死者生前生活用品中分別提取dna，然后借助 dna雜交技術(shù)對遺體進(jìn)行確認(rèn)。請回答下列問題：(1)為了確保辨認(rèn)的準(zhǔn)確性，需要克隆出較多的dna樣品，這需要借助pcr技術(shù)。使用pcr技術(shù)的具體實(shí)驗(yàn)操作順序是：按配方準(zhǔn)備好各組分離心使反應(yīng)液集中在離心管底部一設(shè)計好pcr儀的循環(huán)程序一進(jìn)行pcr反應(yīng)。在該操作過程中應(yīng)特別注意的問題是(2) 如表所示為分別從死者遺體和死者生前的生活用品中提取的三條相同染色體上的同一區(qū)段 dna單鏈的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對情況進(jìn)行判斷， a、b、 c 三組 dna中不是同一人的是a組b組c組遺體中的 dna堿基序列actgacggttggctta

13、tcgagcaatcgtgc家屬提供的 dna堿基序列tgactgccaaccgaatagcacggtaagacg(3) 為什么從死者體細(xì)胞與死者家屬提供的其生前生活用品中分別提取的dna可以完全互補(bǔ)配對 ?解析： 從遺體細(xì)胞和死者家屬提供的死者生前的生活用品中分別提取dna，在一定溫度下，水浴共熱，使dna氫鍵斷裂，雙鏈打開。若兩份dna樣本來自同一個體，在溫度降低時，兩份樣本中的dna單鏈通過氫鍵連接在一起，若不是來自同一個體，則兩份樣本中的 dna單鏈在一定程度上不能互補(bǔ)，dna雜交技術(shù)就是通過這一過程對面目全非的死者進(jìn)行辨認(rèn)的。答案：(1) 用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分pc

14、r實(shí)驗(yàn)使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌- 6 -名校名 推薦(2)b 、c(3) 人體所有體細(xì)胞均由一個受精卵經(jīng)有絲分裂產(chǎn)生，其細(xì)胞核中均含有相同的遺傳物質(zhì)三、血紅蛋白的提取和分離1實(shí)驗(yàn)原理(1) 蛋白質(zhì)各種特性 ( 如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等 ) 的差異，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。(2) 有效方法凝膠色譜法：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)。凝膠是由多糖類化合物構(gòu)成的微小的多孔球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動

15、速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。(3)電泳：蛋白質(zhì)等生物大分子都具有可解離的基團(tuán)，在一定的ph 下會帶上正電或負(fù)電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。故電泳可利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。2 實(shí)驗(yàn)操作程序(2) 粗分離透析將盛有 1 ml 血紅蛋白溶液的透析袋放入盛有300 ml 的物質(zhì)的量濃度為20 mm01 l 的磷酸緩沖液中透析12 h ，去除樣品中

16、的小分子雜質(zhì)。(3) 純化采用凝膠色譜法對血紅蛋白進(jìn)行分離和純化- 7 -名校名 推薦(4) 純度鑒定：一般用 sds一聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，來測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，即對血紅蛋白進(jìn)行純度鑒定?！纠?3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題：(1)以上所述的過程即是樣品處理，它包括、分離血紅蛋白溶液。(2) 收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。透析的目的是。透析的原理是。(3)然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化

17、，最后經(jīng)sds一聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。樣品純化的目的是。血紅蛋白有什么特點(diǎn)?。這一特點(diǎn)對進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義 ?解析： 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑檸檬酸鈉。透析可以去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液，透析袋一般是用硝酸纖維素 ( 又稱玻璃紙 ) 制成的，能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)。血紅蛋白因含血紅素而呈現(xiàn)紅色，在凝膠色- 8 -名校名 推薦譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液，使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作。答案：(1)

18、紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放(2) 去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)(3) 通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜蛋白除去血紅蛋白呈現(xiàn)紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液 使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作【實(shí)戰(zhàn)訓(xùn)練】（ 09 江蘇卷） 23下列關(guān)于 dna和蛋白質(zhì)提取與分離實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的有a提取細(xì)胞中的 dna和蛋白質(zhì)都需用蒸餾水漲破細(xì)胞b用不同濃度 nacl 溶液反復(fù)溶解與析出 dna可去除蛋白質(zhì)c蛋白質(zhì)提取和分離過程中進(jìn)行透析可去除溶液中的dnad蛋白質(zhì)和dna都可以用電泳的方法進(jìn)行分離純化答案： bd解析： a 選項，在提取dna時，如果是用動物的細(xì)胞需要用蒸餾水漲破，如果用植物細(xì)胞則不需要，而是用洗滌劑溶解細(xì)胞膜；用2 mol l 的 nacl 溶液溶解dna，然后過濾出蛋白質(zhì)，再降低 nacl 溶液的濃度，析出dna。 dna和蛋白質(zhì)樣品都是帶負(fù)電荷的，從負(fù)極向正極移動