1、第九章 細胞衰老與凋亡,一 細胞衰老,（一）基本概念 cellular aging / cell senescence 100年前, 人們認為除單細胞原生生物外,多細胞生物的體細胞會衰老和死亡.樸素觀點 雞心臟細胞無限生長和分裂（連續(xù)培養(yǎng)34年）、hela細胞系的建立等實驗，證明了細胞“不死性”的觀點：細胞本身沒有衰老與死亡，細胞衰老的原因不在細胞本身，而是由于體內(nèi)和體外環(huán)境的影響結(jié)果。 有實驗根據(jù) Hayflick Limitation（1961）：細胞不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限。即，細胞的增殖能力和壽命是有限的。,實驗一：胎兒和成人肺成纖維細胞

2、可在體外分別傳代50次和20次（年齡）。 實驗二：早老癥成纖維細胞在體外只能傳代24次（反映細胞在體內(nèi)狀況）。 實驗三：龜（175歲）的培養(yǎng)細胞的傳代數(shù)90125次，小鼠（3.5歲）的傳代數(shù)1428（壽命長短）。 實驗四：老年男性細胞和年輕女性細胞的倍增次數(shù)實驗（巴氏小體標記）。（細胞內(nèi)部，而不是細胞外部決定細胞衰老）。 實驗五：去核的胞質(zhì)體與完整細胞雜交實驗，與胞質(zhì)體細胞的年齡無關(guān)（細胞核決定細胞衰老）。 所以，對于細胞而言，衰老是不可避免的，衰老的原因在于細胞本身。,（二）細胞在體內(nèi)條件下的衰老,細胞的衰老和死亡不僅發(fā)生在成體內(nèi)，發(fā)育早期（蝌蚪尾和期）也有。 測定不同年齡小鼠小腸腺窩上皮細

3、胞的周期長度，發(fā)現(xiàn)隨年齡的增高，細胞衰老，細胞周期長度明顯延長（主要G1期）。 周期的延長就是細胞分裂能力的下降，這種變化是由于體內(nèi)環(huán)境影響的結(jié)果：小鼠皮膚移植實驗F1代、F2代等，皮膚細胞的壽命明顯長于小鼠壽命；老年骨髓造血干細胞復(fù)壯實驗,（三）衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化,細胞核變化：隨著細胞分裂次數(shù)的增加，核不斷增大；核膜內(nèi)折；染色質(zhì)固縮；有的細胞核的核仁裂解為小體。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量呈減少趨勢；原來的有序排列被打亂。體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞在26次倍增前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔膨脹擴大，含有不定型的致密物，且為核糖體所覆蓋；而40次以后細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔未見膨脹，不定型致密物少，且具無核糖體覆蓋區(qū)。

4、 線粒體變化：數(shù)量減少，體積增大，有時外膜破裂。,致密體生成：衰老細胞常見的一種結(jié)構(gòu)。又稱脂褐質(zhì)、老年色素、血褐質(zhì)、黃色素、透明蠟體、殘體等。是由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化而來的。 膜系統(tǒng)變化：年輕細胞的膜相為液晶相，脂雙層柔韌，脂肪酸鏈能自由移動，相鄰脂質(zhì)分子之間的位置交換極其頻繁，膜蛋白表現(xiàn)出最大的生物學(xué)活性。衰老細胞的膜處于凝膠相或固相，磷脂的脂肪酸尾巴“凍結(jié)”，不能自由移動，膜的剛性增大，使膜蛋白不能運動。此時，機械刺激或壓迫，就會出現(xiàn)裂隙，通透性受損。細胞連接明顯減少。,（四）細胞衰老的機制,氧化損傷學(xué)說細胞從外界攝取氧的23%在代謝過程中，產(chǎn)生活性氧基團或分子（reactive oxyge

5、n species,ROS）：超氧自由基（.O2）、羥自由基（.OH）、過氧化氫（H2O2）。它們可引發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷，從而導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)的損傷和破壞。這些氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致細胞衰老。如果清除ROS，就可以延長壽命，如SOD。 有絲分裂鐘學(xué)說Telomere是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，其DNA由簡單的串聯(lián)重復(fù)序列組成。它們在細胞分裂過程中不能被DNA聚合酶完全復(fù)制，而是隨細胞分裂的不斷進行而逐漸變短。隨著細胞的每次分裂，端粒不斷縮短；當端粒長度縮短到一個閾值時，細胞就進入衰老。 端粒酶（Telomerase）可催化合成端粒重復(fù)序列并加在染色體末端。端粒酶由RNA和蛋白

6、質(zhì)組成，前者是合成端粒DNA的模板，后者是反轉(zhuǎn)錄酶亞基。生殖細胞和癌細胞中含有端粒酶。如果將端粒酶基因轉(zhuǎn)染到正常人二倍體細胞中，可明顯延長細胞壽命。,rDNA與衰老在一種酵母（S. cerevisiae）中，已經(jīng)確定細胞衰老的步伐是由rDNA的變化所決定的。rDNA以100200份串聯(lián)拷貝存在于第12號染色體上，在酵母達到中年的某一時刻，通過同源重組產(chǎn)生的第一份環(huán)狀rDNA片段膨沖而出，成為染色體外rDNA環(huán)（ERC）。隨著分裂的進行，ERC不斷復(fù)制增加，當積累到5001000份拷貝時細胞就進入衰老。（與下一個機理密切相關(guān)）,沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物Silencing information r

7、egulator complex, Sir Complex Sir復(fù)合物通常存在于異染色質(zhì)的端粒及與性別決定有關(guān)的HML和HMR位點上，其功能是阻止它們所在位點的DNA的轉(zhuǎn)錄。在Sir突變體中，Sir蛋白由端粒向核仁轉(zhuǎn)移，使核仁rDNA處于沉默狀態(tài)，抑制了復(fù)制及ERC的生成，阻止細胞衰老，而使生命延長。,線粒體DNA與衰老隨著年齡的增長，線粒體DNA的突變是相當顯著的。而線粒體DNA中存在著衰老DNA (Sen-DNA)。由于線粒體DNA參與電子傳遞鏈中某些成分的編碼，所以線粒體DNA的突變可能導(dǎo)致電子傳遞鏈不能執(zhí)行正常功能，促進活性氧基團的生成。 SGS1基因、WRN基因與衰老酵母中，90以

8、上的SGS1蛋白定位于核仁，如果核仁缺少SGS1，它就會裂解。在SGS1突變細胞中，其核仁結(jié)構(gòu)在年輕細胞中正常，而在年老細胞中核仁裂解為小體。人成纖維細胞中，WRN基因也定位于核仁中，其功能是編碼DNA解旋酶，保證細胞生命周期正常進行，如果發(fā)生突變就引起衰老提前發(fā)生和壽命的縮短。,二、細胞凋亡,（一）細胞凋亡的概念及生物學(xué)意義 1965年Kerr觀察大鼠肝細胞，在局部缺血條件下不斷轉(zhuǎn)化為膜包的小的圓形細胞質(zhì)團，稱此現(xiàn)象為“皺縮型壞死”。由于這些細胞質(zhì)團是在生理條件下產(chǎn)生的，1972年改稱為“細胞凋亡”。90年代后，方興未艾。 細胞凋亡（apoptosis）是一種主動的由基因決定的細胞自我破壞過

9、程，自動結(jié)束其生命。由于細胞凋亡受到嚴格的由遺傳機制決定的程序性調(diào)控，又稱為細胞編程性死亡（programmed cell death,PCD）。,通過細胞凋亡，有機體清除不再需要的細胞（蝌蚪尾消失、手和足的成形、50%的神經(jīng)細胞；成體的骨髓和腸每小時有10億個細胞凋亡、被病原感染細胞的清除）；淋巴細胞的克隆選擇過程中，細胞凋亡起著關(guān)鍵的作用；各種免疫細胞對靶細胞的攻擊并引起其死亡，也是基于細胞凋亡。 誘導(dǎo)細胞凋亡的因子有兩大類： 物理因子射線（紫外線、射線）、較溫和的溫度刺激(熱激、冷激) 化學(xué)及生物因子活性氧基團和分子、Ca2+載體、VK3、視黃酸、細胞毒素。DNA和蛋白質(zhì)合成抑制劑、正常

10、生理因子（激素、細胞生長因子）的失調(diào)、腫瘤壞死因子等。,細胞凋亡舉例,（二）細胞凋亡與壞死,細胞壞死與細胞凋亡是兩種完全不同的過程和生物學(xué)現(xiàn)象，它是因病理而產(chǎn)生的被動死亡,細胞膜發(fā)生滲漏，細胞內(nèi)容物釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。,（三）細胞凋亡的變化過程,形態(tài)學(xué)變化過程： 凋亡的起始歷經(jīng)數(shù)分鐘。細胞表面的特化結(jié)構(gòu)（微絨毛）消失，細胞間連接消失，但細胞膜完整并具選擇透性；線粒體基本完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形結(jié)構(gòu)，沿核膜分布。 凋亡小體的形成染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器（線粒體）一起聚集，被反折的細胞膜所包圍，使細胞表面形成了

11、許多泡狀或芽狀突起。以后，逐漸分割，形成單個的凋亡小體。 凋亡小體逐漸為鄰近的細胞所吞噬并消化。整個凋亡過程需要49小時。,a 正常T細胞雜 b 凋亡細胞； c 凋亡細胞(透射電鏡) 交瘤細胞；,生化變化過程： 在核酸內(nèi)切酶（Ca2+ / Mg2+激活；Zn2+抑制）的催化下，核小體間的DNA斷裂，產(chǎn)生含有180200bp整倍數(shù)的片段。這些片段在進行瓊脂糖凝膠電泳時，形成了特征性的梯狀條帶(DNA ladders)。這也是鑒定細胞凋亡的一種可靠方法。 凋亡細胞的組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)不斷積累并達到較高水平。tTG催化某些蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合。這些蛋白質(zhì)不溶于水，不為溶酶體所降

12、解，它們進入凋亡小體，有助于凋亡小體完整性的保持，防止有害物質(zhì)逸出。,（四）細胞凋亡的檢測,主要基于DNA的斷裂。 形態(tài)學(xué)觀察各種染色法：臺盼藍； DAPI是一種與DNA結(jié)合的熒光染料， 可觀察細胞核的形態(tài)變化； Giemsa染色可以觀察染色質(zhì)固縮、趨邊、 凋亡小體的形成等；透射電鏡和掃描電鏡。 兩種染料復(fù)染更好。 DNA電泳凋亡細胞中提取的DNA進行常規(guī) 瓊脂糖電泳時，大小不等的DNA片段（180 200整倍數(shù)）呈現(xiàn)梯狀條帶。,彗星電泳法（comet assay）將單個細胞懸 浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場 中進行短時間的電泳，用熒光染料染色后，凋 亡細胞中形成的DNA降解片段在電

13、場中泳動速 度不同，使細胞呈現(xiàn)一種彗星式的圖案；而正 常的無DNA斷裂的核在泳動時保持圓球形。 流式細胞分析采用碘化丙錠使凋亡細胞 DNA片段產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細胞儀檢出 凋亡的二倍體細胞，同時又能觀察細胞的周 期狀態(tài)。,（五）細胞凋亡的機制,1、caspase家族與凋亡 Cysteine aspartic acic specific protease是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，存在于細胞質(zhì)中，共同特點是能特異性斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。所以，可以選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，使其活化或失活。目前發(fā)現(xiàn)11種caspase成分（caspase111）， 其中，1、11和4不直接參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而是參與白介素的活化；2、8、9和10參與細胞凋亡的起始；3、6和7參與細胞凋亡的執(zhí)行。 哺乳類細胞內(nèi)存在編程性細胞死亡抑制因子（inhibitor of apoptosis,IAP）家族，如XIAP, cIAP1, cIAP2，可特異地抑制caspase3和7。,2、Bcl2家族 Bcl2是 一種原癌基因，能延長細胞的生存，抑制細胞凋亡。 在胚胎發(fā)育過程中，BCL2的表達十分常見，但在成熟組織中，只有那些長期生存的細胞（干細胞、分裂后的神經(jīng)元等細胞）才表達。Bcl2家族成員的基因中，常常含有三個保守