1、PCR技術(shù)的基本原理,PCR的反應(yīng)動力學(xué) PCR反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量,Y(1X)n Y:DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù) X:每次擴(kuò)增效率的平均值 n:循環(huán)次數(shù)。 平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。,平臺期(Plateau) 反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺期 產(chǎn)生的因素: dNTP和引物濃度下降 酶與模板的比例下降，能參與反應(yīng)的酶分子數(shù)下降 多次循環(huán)后酶與dNTP的穩(wěn)定性下降 非特異產(chǎn)物及引物二聚體比例增加 產(chǎn)物濃度高時變性不

2、完全，影響引物的延伸，產(chǎn)物濃度過高108M時，降低Taq酶的延伸與加工能力。 大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR反應(yīng)應(yīng)在平臺期前結(jié)束。,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段 短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。 短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成. 在一個反應(yīng)周期中， 以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3端開始延伸， 其5端是固定的，3 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。 第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時， 由于新鏈模板的5端序列是固定的， 這

3、就等于這次延伸的片段3端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。 “短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計,酶及其濃度 Taq DNA聚合酶, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。 除Taq DNA聚合酶，還有其它一些熱穩(wěn)定聚合酶。 催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)， 濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，甚至PCR產(chǎn)物為彌散，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。,dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP保存不當(dāng)

4、易變性失去生物學(xué)活性。 dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M TrisHCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。 4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。 在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。 dNTP能與Mg2+結(jié)合，因此濃度過高，使游離的Mg2+濃度降低，并抑制Taq酶活性。,Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響 Mg2+濃度要比dNTP濃度高0.22.5mM。 Mg2+濃

5、度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 2mMMgCl2在dNTP為0.7-0.8mM時,對Taq酶活性促進(jìn)最強(qiáng) 10mM時對Taq酶抑制達(dá)40-50% 模板和引物中磷酸根結(jié)合Mg2+,將降低自由Mg2+ KCl(50mM)可使Taq酶活性增加50-60%.,模板(靶基因)核酸 DNA與RNA均可成為PCR的模板。 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一 PCR的模板可以純化也可以是粗提液。但不管是什么類型在模板中均不應(yīng)存在Taq酶抑制劑。 模板量要求為102105靶序列。一般對于單拷貝模板來講，高等真核生物基因約需1

6、ug,酵母約需10ng，質(zhì)?；虼竽c桿菌需要量1ng。,引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物。 設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長度： 15-30bp，常用為2027mer左右。引物的有效長度用Ln表示，其數(shù)值為2（GC）（AT）引物擴(kuò)增跨度： 以2003000bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。,避免引

7、物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。在3端不要出現(xiàn)3個連續(xù)的G或C。同時3端不要出現(xiàn)T尤其不要出現(xiàn)2個或以上的T。引物3端最好不要中止于密碼子的第3位.引物5端可加上合適的酶切位點， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點，或各種標(biāo)記物及待突變堿基。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。 引物量： 每條引物的濃度0.21umol或20100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異

8、性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。但過低將降低反應(yīng)產(chǎn)物。,引物二聚體(primer-dimer) 在大部分引物二聚體中,一個引物的延伸部分是另一種引物的反向平行互補(bǔ)序列,二聚體能被有效擴(kuò)增,并能成為主要PCR產(chǎn)物. 一對引物間3端互補(bǔ)能促進(jìn)二聚體的形成 一對引物間3端無互補(bǔ),但在低復(fù)性溫度,高酶濃度及高引物濃度及足夠的循環(huán)數(shù)下仍能形成二聚體 Taq酶能非特異添加堿基,當(dāng)一條引物與酶的引物位點結(jié)合,另一條引物與酶模板結(jié)合位點結(jié)合時,第一條引物的3端即能以第二條引物為模板添加堿基,促成了兩引物間的反應(yīng).,PCR反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法

9、 9095變性， 40 60，引物退火, 7075，引物鏈沿模板延伸。 對于較短靶基因(長度為100300bp時)可采用二溫度點法， 退火與延伸溫度可合二為一，94變性，65左右退火與延伸。,變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全,導(dǎo)致PCR失敗。 一般情況下，939430sec-lmin足以使模板DNA變性。 一般進(jìn)行單向PCR或RAPD等循環(huán)數(shù)多的擴(kuò)增時,變性時間要求短。 退火溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。 復(fù)性溫度 4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。 退火溫度與時間，取決于引物

10、的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。,引物的復(fù)性溫度可通過以下公式計算：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510) 或按照以下公式計算 Tp=22+1.46Ln,Ln=2(G+C)+(A+T),復(fù)性溫度為Tp2-5在復(fù)性值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。 復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合，復(fù)性時間過長，將導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加。根據(jù)經(jīng)驗一般特異性PCR復(fù)性溫度可從4856間實驗選定，而R

11、APD、dd-PCR等復(fù)性溫度采用3742,延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 100核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90時， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。 PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72. 過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定， 2Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1-2min是足夠 的。 34kb的靶序列需24min； 10Kb需延伸至15min。 延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。但PCR延伸反應(yīng)中前幾個循環(huán)時，延伸時間可梢長。對低濃度模板的

12、擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。,循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。 一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。循環(huán)數(shù)與模板拷貝數(shù)相關(guān)，一般初始靶序列為3105、1.5104、1103及50拷貝時，循環(huán)數(shù)應(yīng)分別為2530，3035，3540，4045。,影響PCR反應(yīng)的其它因素 1，高溫啟動，可減少非特異性產(chǎn)物及引物二聚體形成。 對Tfu等高保真酶擴(kuò)增時可減少對引物的降解。 2，PCR促進(jìn)劑 DMSO（二甲基亞砜）有促進(jìn)DNA變性作用，因此有時建議添加10的DMSO，但DMSO對Taq酶有抑制作用，一般PCR中不用，但復(fù)

13、合PCR中可使用。 甘油，520的甘油有助于PCR的復(fù)性過程，尤其對于GC含量高和二級結(jié)構(gòu)多或長片段靶序列有用，但一般PCR中不加甘油。 TMAC（氯化四甲基胺），PCR中加入0.01-0.1mM的TMAC可促進(jìn)PCR去除非特異擴(kuò)增。 gp32(T4噬菌體基因32蛋白)加入1nM的gp32可使長片段DNA擴(kuò)增效率提高10倍。,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)計的大小。 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用12%的瓊脂糖凝膠， 供檢測用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺

14、凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。 酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。 Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀。 斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色

15、斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。,原位PCR 原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù). 原位PCR是Hasse等于1990年建立的 實驗用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等. 其基本方法為固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶.蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55消化處理2h后，962min以滅活蛋白酶K.PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，

16、覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交.顯微鏡觀察結(jié)果.,連接酶鏈反應(yīng) 連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR)，主要用于點突變的研究及靶基因的擴(kuò)增. 1997年,Backman為檢出靶基因序列中的點突變而設(shè)計發(fā)明. 1988年Landegren也進(jìn)行了該項研究. 1988年Backman等分離熱穩(wěn)定的連接酶 1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶進(jìn)行了LCR試驗.耐熱DNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特

17、異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁瑣程序.,LCR的基本原理 利用DNA連接酶.特異地將雙鏈DNA片段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增. 其程序為: 在模板DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下， 9495,DNA變性，雙鏈打開， 降溫退火(65)，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補(bǔ)，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增.若連接處的靶序列有點突變，引物不能與

18、靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物. LCR的引物是兩對分別互補(bǔ)的引物，引物長度為2026個，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCR識別點突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識別單核苷酸錯配的特異性極高. LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個溫度循環(huán)，94min變性和65復(fù)性并連接，循環(huán)30次左右.其產(chǎn)物的檢測也較方便靈敏.目前該方法主要用點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多

19、態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等.,LCR的引物是兩對分別互補(bǔ)的引物，引物長度為2026個，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCR識別點突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識別單核苷酸錯配的特異性極高. LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個溫度循環(huán)，94min變性和65復(fù)性并連接，循環(huán)30次左右.其產(chǎn)物的檢測也較方便靈敏.目前該方法主要用點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的

20、產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等.,依賴核酸序列的擴(kuò)增 (Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又稱 自主序列復(fù)制系統(tǒng)(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生長序列復(fù)制技術(shù). 1990年Guatelli等首先報道了這一技術(shù). NASBA主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測及測序. 該反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作而完成. NASBA反應(yīng)體系中除含有上述三種酶外，還含有dNTP，NTP,兩種特殊的引物和緩沖液. 引物I 3末端與靶序列互補(bǔ)，

21、5端含T7RNA多聚酶的啟動子， 引物的堿基序列與cDNA的5未端互補(bǔ).,在NASBA反應(yīng)時，引物與RNA模板復(fù)性(結(jié)合)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA; 引物隨即與此cDNA的5未端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈. DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動子.該酶即以此DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈，而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA. 其基本方法為:將引物，標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液

22、，651min使RNA分子二級結(jié)構(gòu)打開，降溫至37加入逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37反應(yīng)11.5小時 .NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán).整個反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高，其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好.,Q復(fù)制酶反應(yīng) Kacian等于1972年首次報報Q復(fù)制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我復(fù)制功能. 在常溫30min，將其天然模板MDV-1RNA擴(kuò)增至109. 1986年Chu等報道用生物標(biāo)記的靶序列特異性探針，可與親和素聯(lián)接的MDV-1RNA雜交，經(jīng)洗脫未被結(jié)合的MDV-1后，再加入Q復(fù)制酶，擴(kuò)增復(fù)制MDV-1拷貝，然后用溴乙錠染色檢測或用同源性的第二探針雜交. Q復(fù)制酶是一種RNA指導(dǎo)的RNA