1、細胞爬片免疫熒光實驗步驟第一天：1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4孵育過夜；第二天：6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20

2、-37孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。7. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標(biāo)本進行染核，PBST 5min4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。細胞免疫熒光步驟1.在24孔板里加500微升培養(yǎng)基，放爬片，接種細胞（做實驗以30-50%匯合度較好。10000-30000左右2.給藥處理24h。3.PBS洗三遍。4.4冷的多聚甲醛固定15分鐘，PBS洗三遍，每次5min，搖床。（避光）5.0.5TritonX100（PBS配）破膜15mi

3、n，PBS洗三遍，每次5min，搖床。6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封閉60分鐘,不用洗。7.加一抗孵育（5%BSA配），4搖床過夜。8.收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，搖床。孵育二抗AlexaFluor488（1:1000）,室溫60min（避光）9. 回收二抗，PBS洗三遍，搖床，每次5min。10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光）11.PBS洗三遍，每次5min，搖床。12.取載玻片，滴加10uL抗熒光衰減封片劑，將爬片有細胞面蓋在封片劑上，指甲油封片子的對角線。Allstepsfor IF 1)Removecultureme

4、diumandfixcells(acommonfixativeis4%formaldehydeinPBS,for15minutes)2)WashwellinPBS(3x5minutesistypical)3)Permeabilizethecells(acommonpermeabilizationreagentis0.2%TritonX-100inPBSfor30minutes)4)WashwellinPBS5)(optional:Blockfornon-specificdyebindingusingtheImage-iTFXImageEnhancerSolution,I36933)6)Bloc

5、kfornon-specificantibodybinding30-60minutes(acommonblockingsolutionwouldbe3-6%bovineserumalbumin/5%normalgoatserum/PBS,orcommercialblockingreagentslikeourBlockAid,productB10710)7)Incubateinprimaryantibodyfor30-60minutes,inblockingsolutionorovernightat4degrees(antibodyconcentrationsvary,butusuallybetween0.5-10ug/mL)8)WashwellinPBS9)Incubateinsecondaryantibodyfor30-60minutes,in3-6%bovineserumalbumin/PBS(agoodstartingantibodyconcentrationis5ug/mL)10)WashwellinPBS11)Counterstainasneeded(suchaswithDAPI,D1306)12)Mountinappropriatemountingmedium(forfluore