1、干細胞分選技術(shù)（綜述）引言干細胞是一類具有自我復(fù)制和分化潛能的細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。新近研究表明干細胞可以為臨床細胞替代治療和移植治療提供新的細胞來源，有廣闊應(yīng)用前景。背景資料干細胞的概念干細胞是指那些具有自我更新能力，在一定的條件下又能產(chǎn)生各種高度分化的子代細胞的增殖性細胞。目前公認的干細胞所應(yīng)具備的幾點主要的細胞生物學(xué)特點：（1）具有自我更新能力與自我維持能力，也就是說它可以分裂，分裂后的子細胞與母細胞一樣不但能保持其原有的各種細胞生物學(xué)特性，而且還可以不斷地分裂下去。干細胞一旦形成，在機體內(nèi)終生都具有自我更新能力，不同于那些具有有限自我更新能力的祖細胞。這對于維持機體組織器官

2、的穩(wěn)定性有很重要的意義。（2）具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化發(fā)育成各種胚層組織的細胞（ES細胞），或可以分化成為本系統(tǒng)各譜系的細胞（特定組織干細胞，如造血干細胞）。（3）具有高度增殖能力，在體內(nèi)干細胞的高度擴增具有非常重要的意義，如造血干細胞通過高度擴增補充由于細胞正常衰老而喪失的細胞；同時由于干細胞雖具有多能性但數(shù)量不多，因而只有通過體外擴增才能對其進行研究。因此干細胞高度擴增不但對機體正常功能的維持起著非常重要的作用，而且對干細胞的研究和應(yīng)用也有著非常重要的作用。（4）既具有生理性的更新能力，也具有對損傷或疾病導(dǎo)致的反應(yīng)與修復(fù)能力，如骨髓間充質(zhì)干細胞等。（5）干細胞的自我

3、更新與分化需要特定的微環(huán)境，即nitches，也就是說干細胞往哪一種方向分化，必須在該細胞生存的特定微環(huán)境前提下進行分化。已有諸多的實驗表明，如將ES細胞種植入小鼠大腦內(nèi)，這些干細胞將向神經(jīng)系統(tǒng)分化。干細胞的分類根據(jù)干細胞的來源、發(fā)育階段、分化趨勢將它們分為兩大類：ES細胞和成體干細胞（或稱之為特定組織干細胞，如造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞等）。ES細胞 ES細胞是從附置前早期胚胎內(nèi)細胞團或附置后胚胎原始生殖細胞分離克隆的一類具有自我更新能力和發(fā)育全能性的，并能產(chǎn)生分化后代能力的早期胚胎細胞，包括畸胎瘤干細胞(EC細胞)，ES 細胞,胚胎生殖細胞(EG細胞)。它們的基本特性是具有發(fā)

4、育的全能性，能分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的各種分化細胞，即具有分化成為機體內(nèi)任何一部分組織和器官的能力，因而有人稱之為“萬能”細胞。EC細胞具有惡性生長并顯示出類似于胚胎細胞發(fā)育全能性或多能性的雙重性質(zhì)，早在20世紀七八十年代，EC細胞常常被用來作為研究哺乳動物發(fā)育和遺傳的模型，以及作為誘導(dǎo)細胞分化的模型，并且已經(jīng)成功地誘導(dǎo)出了神經(jīng)細胞，肌細胞,軟骨細胞及上皮細胞等包括( 個胚層在內(nèi)的各種類型分化細胞。但是EC細胞具有核型異常等惡性腫瘤的特性，難以參與嵌合體胚胎的發(fā)育，用它們作為研究正常人體細胞分化的模型并不合適。故在20世紀90年代初期，科學(xué)家們從小鼠的早期胚胎的桑葚胚中分離并建立了E

5、S細胞系，并逐漸趨向以大動物如豬,狨等為研究對象，力圖解決哺乳動物的細胞分化的模型難題。終于在1998年，人們迎來了夢寐以求的喜訊：美國的威斯康星大學(xué)的Thomson等和霍普金斯大學(xué)的Gearhart實驗小組分別報道用不同材料,不同方法成功地分離并建立具有多向分化潛能和永久生殖能力的ES細胞系和EC細胞系。研究模型的解決，為人類的健康和現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展、研究開創(chuàng)了一個新時期。EG細胞是從人和小鼠的生殖脊分離培養(yǎng)出來的類似于ES細胞的一類具有發(fā)育全能性的細胞系。它具有與來自IEM的ES細胞相同的特征，包括細胞的體外分化和產(chǎn)生生殖系嵌合體后代，但它們并非完全一樣：首先EG細胞的培養(yǎng)與建系較ES細

6、胞困難，EG細胞所需的培養(yǎng)條件特別是飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)較ES細胞的培養(yǎng)苛刻得多；其次EG細胞與ES細胞在形態(tài)特征上也不同。成體干細胞 成體干細胞也稱為特定組織干細胞，是指成體組織中所存在的具有自我更新與產(chǎn)生本系統(tǒng)后繼續(xù)分化能力的那類細胞，它們在特定的條件下，可以對稱地分裂為2個新的子代干細胞或2個功能細胞，也可以不對稱地分裂成1個子代干細胞和1個功能干細胞，從而使組織分化成與器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。傳統(tǒng)的觀點曾認為成體干細胞的分化潛能較弱，只能分化成與其組織來源一致的某種特定的組織細胞。然而在某些情況下，干細胞的分化并不遵循這一規(guī)律。文獻報道在實驗中分離出小鼠的肌肉干細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)5d

7、后，將它與小量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化成為各種造血干細胞系。這種現(xiàn)象被稱為干細胞的可塑性分化。迄今對成體干細胞研究較多的是造血干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞；其次神經(jīng)干細胞的研究也較多；以及成肌干細胞和皮膚干細胞。也許是人們渴望找到一種對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的有效治療方法，近年來對于神經(jīng)干細胞的研究頗多也頗深入，并且已經(jīng)有實驗表明神經(jīng)干細胞的移植可以治愈帕金森病。干細胞的應(yīng)用隨著細胞替代治療的發(fā)展，干細胞移植治療已成為臨床上治療某些疾病的重要手段，利用干細胞在體外擴增培養(yǎng)并誘導(dǎo)成所需要的細胞后移植入患者體內(nèi)，用于組織損傷的修復(fù)、退行性器官的替代及改善遺

8、傳性缺陷組織器官的功能。而成體干細胞可塑性分化的發(fā)現(xiàn)，為細胞替代治療提供了新的種子細胞。干細胞的分離純化 所謂細胞分離（cell isolation）,指的是將組織分散制成細胞懸液后從中獲取目的細胞的過程。而所謂細胞純化更進一步強調(diào)從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細胞的過程。通過細胞的分離和純化過程，使培養(yǎng)物成為單一類型培養(yǎng)物，甚至是遺傳特性完全一致的培養(yǎng)物，后者即細胞系。分離和純化兩個概念之間沒有截然的界限，許多情況下，細胞分離和純化并不是完全徹底的，培養(yǎng)物中只能達到以某種細胞為主的程度，所以也成稱為富集(enrichment)。 分離和純化細胞的過程不僅僅在

9、原代培養(yǎng)之前進行的，有時分離和純化細胞的過程還貫穿于原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的過程中，甚至是主要依賴培養(yǎng)過程實現(xiàn)分離和純化細胞的目的。培養(yǎng)物中細胞成分是否單一或者目的細胞在培養(yǎng)物中的比例如何，常是衡量某一培養(yǎng)工作是否成功的重要指標。 從成分混雜的細胞懸液中將不同的細胞區(qū)分開來達到分離純化，主要是依據(jù)不同的細胞具有各種不同的特性來實現(xiàn)的，也可利用細胞的物理特性如密度，體積，電荷等，以及細胞生物學(xué)特性如特異的表面標志和功能。一種細胞，其數(shù)量稀少又難以識別往往就更不容易被分離純化。因詞雖然已經(jīng)對造血干細胞的特性了解得比較清楚，但人們?nèi)栽谂μ剿鞲唵?，更快捷的干細胞分離方法，因為通過常規(guī)方法富集到的干細胞

10、遠不能滿足干細胞生物學(xué)和調(diào)控研究對干細胞數(shù)量和純度的要求。將基于干細胞的物理特性和生物學(xué)特性的分離純化方法相結(jié)合，通?？梢垣@得較好的效果，也只有通過合理的綜合應(yīng)用兩種以上不同的分離純化方法，才可能在細胞回收率，細胞純度及細胞活力等方面達到比較滿意的效果。尤其是干細胞在組織中比例極低，也使人們不得不采用多步驟的分離方法，通常每一步驟都采用一種不同的分離參數(shù)。例如，在抗體介導(dǎo)的分離技術(shù)之前常西安用密度梯度法對目的細胞進行富集。 最初的“預(yù)富集”步驟可以看作是減少體積的步驟，紙樣可以減少隨后分離步驟中世紀的用量。當采用多級分離步驟時，預(yù)先估計整個過程中的細胞損失是非常重要的，因為為了獲得高純度的細胞

11、可能會影響到細胞的回收率。細胞分離純化的常用技術(shù)與基本原理解離組織制備細胞懸液 為了分離目的細胞首先必須將目的細胞所在的動物組織材料制備成單細胞懸液。細胞分散一方面是細胞分離純化的前提；另一方面，在分散細胞的過程中，通過一定的輔助性方法，也能對組織細胞起到一定的分離純化作用。 機械分離以及酶學(xué)分離是組織分散成單細胞最常用的方法。在機械風(fēng)力方法中，常用的技術(shù)包括用吸管或針頭吹打，用組織研磨器或注射器研磨，用不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)搓洗等。其中按照組織內(nèi)不同細胞的大小差異，亦一定孔徑的不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)過濾細胞起到了對細胞的初步分離純化目的。在酶學(xué)解離的方法中，常用的技術(shù)包括用胰蛋白酶消化，用螯合劑處理，永

12、不涵鈣鎂離子的溶液浸泡等。用酶學(xué)方法達到部分分離純化的主要依據(jù)是不同組織細胞和間質(zhì)的構(gòu)成不同。例如，欲從皮膚材料中獲取上皮細胞，就可利用皮膚的表皮和表皮結(jié)締組織間的細胞間質(zhì)構(gòu)成不同的差異，就可先用胰蛋白酶消化這樣就可以得到大量的上皮細胞。密度梯度離心技術(shù) 利用細胞體積和密度進行分離純化的技術(shù)均基于沉降作用。其基本原理是，在離心力的作用下，細胞在一定介質(zhì)中的的沉降速率與細胞的體積及細胞密度和其周圍介質(zhì)的密度之差成正比。細胞的體積越大，其余分離介質(zhì)的密度差越大，則細胞的沉降速率越快。對于特定的待分離細胞來說，其體積和密度是恒定的，可供選擇的只是具有一定密度與黏度的分離介質(zhì)。使之沉降的細胞密度應(yīng)該比

13、介質(zhì)大，而使之漂浮的細胞密度應(yīng)該比介質(zhì)小。因此實施沉降技術(shù)分離細胞的關(guān)鍵在于選擇密度梯度形成介質(zhì)，故稱將技術(shù)也稱為密度梯度離心技術(shù)。 逆流淘析分離技術(shù)是通過含細胞介質(zhì)溶液的流力和福利與細胞所受離心力之間相互作用而分離細胞的一種技術(shù)。細胞置于一特殊的離心室中，離心室成錐形狀，其定點指向沉降方向，細胞懸浮于以向心方向連續(xù)流動的介質(zhì)溶液中，同時受到離心力的作用。當向外的離心力于內(nèi)向的流立即浮力達到平衡時，每個細胞將按照它的的沉降速率達到其平衡位置。通過這一技術(shù)可進一步分離淋巴細胞和單核細胞。選擇性細胞凝集 羥乙基淀粉和甲級纖維素可以使紅細胞形成大的“錢串”，加速其沉降，從而比其他細胞更快地從造血細胞

14、懸液中沉降出去。這一方法通常用于快速去除大量成熟紅細胞，而不會對有核細胞群造成太大的損失。但是，與上面提到的密度梯度離心和逆流淘析步驟一樣，這一方法并沒有使干細胞群相對于有核細胞發(fā)生太多的富集?；诓煌掣教匦缘募毎蛛x方法 粘附于某些固相物質(zhì)如玻璃或塑料的表面，使某些類型細胞的基本生物學(xué)特性之一，但另一些細胞卻缺乏這種能力；或某些細胞的粘附能力強，粘附作用快，而某些細胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根據(jù)這些差異，可以分離或消除某些類型的細胞。這種將粘附較快的細胞與粘附較慢的細胞（貨物粘附能力）的細胞分離開來并分別收集的處理過程就稱為差粘附處理。差速粘附處理常用于分離細胞懸液中的成纖維細胞與其它組

15、織細胞。利用細胞表面標志分離純化細胞的方法 單克隆抗體的特異性和多樣性是利用不同抗體的合理組合分離不同類型的細胞成為可能。目前抗體介導(dǎo)的細胞分離技術(shù)主要有：抗體/補體介導(dǎo)細胞溶解法，流式細胞儀分選法，平面粘附分離法，免疫磁珠分離法等。從抗體介導(dǎo)技術(shù)獲得細胞的家渡看，又可分為陽性細胞分選法和陰性細胞分選法。擬從混雜細胞群體中獲得表達與抗體相應(yīng)膜抗原的細胞群，稱為陽性細胞分選法；反之，擬除去表達與抗體相應(yīng)膜抗原的細胞，而收集其余的細胞群體，稱為陰性細胞分選法。其中上述抗體/補體介導(dǎo)細胞溶解法為陰性細胞分選法，其余3種方法既可以作為陽性細胞分選技術(shù)，也可以作為陰性細胞分選技術(shù)。免疫溶解法 當補體存在

16、時，用抗細胞某一表面標志的特異性抗體與異質(zhì)性細胞一起孵育，可以是具有該特異性表面標志的細胞溶解。利用這一原理，將消除細胞的特異性表面標志的抗體和補體加入細胞須阿畢業(yè)或細胞培養(yǎng)物中，使抗體及補體作用于具有相應(yīng)抗原的細胞并溶解之，而對該抗原陰性的細胞進行富集。細胞溶解法適用于細胞懸液或細胞培養(yǎng)物中待消除細胞數(shù)量不是很大的情況。流式細胞分選術(shù)流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是70年代初發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，綜合應(yīng)用光學(xué)、機械學(xué)、流體力學(xué)、電子計算機、細胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，對高速流動的細胞或亞細胞進行快速定量測定和分析的方法。80年代開始從基礎(chǔ)研究發(fā)展到臨床醫(yī)學(xué)研究及疾病的診斷和治療監(jiān)測。流式細胞術(shù)是對單個微粒（如細胞、微生物和人工合成微球等）進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號（分別代表熒光、散射光、光吸收或細胞光阻抗），送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flowcytometer）。免疫磁珠分選技術(shù)用免疫磁珠做細胞分選(MAC