1、免疫原和抗血清制備技術(shù),第一節(jié) 免疫原的制備 第二節(jié) 免疫血清的制備 第三節(jié) 抗體的純化和鑒定,第一節(jié) 免疫原的制備,一、細(xì)胞性抗原的制備 二、可溶性抗原制備及鑒定 三、半抗原免疫原的制備 四、佐劑,綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖,搖動 15-20min,4,可保存3周,取適量,NS洗滌3次 2000r/min 10min,NS稀釋至 25%,細(xì)菌細(xì)胞抗原的制備流程圖,液體培養(yǎng)或 斜面培養(yǎng) 3724h,100水浴 22.5h 殺菌,無菌試驗(yàn),NS稀釋成810億/ml,O菌體抗原,返回,來源: 組織和細(xì)胞，其成分比較復(fù)雜。 1.組織和細(xì)胞成分混合抗原制備 2.蛋白質(zhì)抗原制備 3.核酸抗原制備 4.類脂多

2、糖抗原制備 5.免疫球蛋白片段制備 6.純化抗原的鑒定,二、可溶性抗原制備及鑒定,可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、 補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制備及鑒定,返回,組織和細(xì)胞成分混合抗原制備程序,上清液 澄清,所用材料必須是新鮮或低溫保存的,去除包膜或結(jié)締組織,臟器進(jìn)行灌洗,洗去血跡 及污物,NS內(nèi)含0.5gL NaN2,冷浴中組織剪碎,裝入搗碎機(jī)簡內(nèi)高速 粉碎制成組織勻漿液,3000rmin10min,取上清液,去除細(xì)胞碎片 及微小組織,離心,細(xì)胞破碎技術(shù)及評價,1.酶處理法 2.凍融法 3.超聲破碎法 4.表面活性劑處理,細(xì)胞破碎技術(shù)及評價,常用酶類：溶菌酶、纖維

3、素酶、蝸牛酶等,1.酶處理法,1.酶處理法,方法：在一定的條件下，能消化細(xì)菌和 組織細(xì)胞。,特點(diǎn)：此法適用多種微生物； 具有作用條件溫和； 內(nèi)含物成分不易受到破壞； 細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。,2.凍融法,原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。,2.凍融法,完,方法：將待破碎的細(xì)胞置冰箱內(nèi)凍結(jié)，然 后緩慢融化，如此反復(fù)兩次，大部分組織 細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？杀蝗谄?。,特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞，對微生物細(xì) 胞作用較差。,3.超聲破碎法,原理：利用超聲波的機(jī)械振動而使細(xì)胞破碎。 由于超聲波發(fā)生空化作用（cavitation）使得 液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)生流

4、動，漩渦生成與消失時，產(chǎn)生很大的壓力，使細(xì)胞破碎。超聲波使用的頻率從1kHz20kHz不等，間歇進(jìn)行，避免長期超聲產(chǎn)熱，導(dǎo)致抗原破壞。,3.超聲破碎法,特點(diǎn)：操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間； 多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。,4.表面活性劑處理,原理：在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH及低離子強(qiáng)度的條 件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡， 使膜的滲透性改變或使之溶解。,4.表面活性劑處理,常用的有：十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型)、 二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯 （非離子型）、新潔爾滅等。,應(yīng)用：破碎細(xì)菌，且作用比較溫和； 提取核酸時，常用此法破碎細(xì)胞。,蛋白質(zhì)抗原制備,蛋白質(zhì)是良好的抗原，要制備特

5、異性高 的抗血清通常需要純化?？刹捎茫?1.超速離心法 2.選擇性沉淀法 3.凝膠層析法 4.離子交換層析法 5.親合層析法,蛋白質(zhì)抗原制備,1超速離心法,原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度 的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。,1超速離心法,特點(diǎn)：用超速離心或梯度密度離心法純化抗 原，極難將某一抗原成分分離出來。,應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕 的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球 蛋白、載脂蛋白A、B等。,2、選擇性沉淀法,原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用 各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原 成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。

6、,2、選擇性沉淀法,常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解 度不同）；常用3350飽和度的硫酸胺。,特點(diǎn)：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。,應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。,3凝膠層析法（凝膠過濾法）,原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)， 經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種 分子大小不一的混合物加在凝膠床面時，大分 子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，在凝 膠顆粒之間的空隙中很快地通過凝膠床，短時 間內(nèi)被洗脫出來；而分子較小的物質(zhì)則進(jìn)入凝 膠網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，反復(fù)受到阻滯，洗脫較慢。分 成大、中、小三種類型。,3凝膠層析法（凝膠過濾法）,4離子交換層析法,原理：利用帶離子基團(tuán)的纖

7、維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時，逐步增加流動相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位 置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。,4離子交換層析法,5親和層析法（親和色譜）,原理：依據(jù)抗原抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行分離和提純的技術(shù)。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質(zhì)上，制成免疫吸附層析柱。當(dāng)樣品流過此柱時，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗IgG)結(jié)合；當(dāng)改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗脫下來，達(dá)到純化的目的

8、。 優(yōu)點(diǎn)：提取純度高、抗原抗體不失活性。,5親和層析法（親和色譜）,正常細(xì)胞 ,標(biāo)記細(xì)胞 洗滴,標(biāo)記細(xì)胞 被酶裂解,加入特異 性抗體,其它蛋白 洗滌流失,SDS-PAGE 分離蛋白,親和層析法示意圖,核酸抗原制備,大分子的核酸具有免疫原性。 提取核酸的主要步驟：,核酸抗原制備,破碎細(xì)胞,核酸從細(xì)胞中游離出來,酸沉淀核,除去蛋白質(zhì),乙醇,酚和氯仿,類脂多糖抗原制備,苯酚法提取LPS：,干燥菌體或濕菌體,水中 混勻,激烈攪勻 加熱5min,冰水 急冷,降至10以下,離心,上層的水層(含LPS) 下層的酚層 菌體殘?jiān)诘撞?吸取 水層,透析 除酚,加熱,超速離心,濃縮,LPS 在上層沉淀的透明膠狀部

9、內(nèi),絞出,懸于水中,離心,得純化LPS,類脂多糖抗原制備,同溫的苯酚,免疫球蛋白片段制備,1酶裂解法 酶對免疫球蛋白的水解有極好 的專一性，不同的酶可將免疫球蛋白裂解 為不同的片段。,免疫球蛋白片段制備,2氧化法和還原法 是將免疫球蛋白輕、重 鏈分開的兩種常用方法。,3. 還可用強(qiáng)變性劑或利用改變pH將免疫球蛋 白亞單位分開。,酶水解免疫球蛋白示意圖,Fc段，用以制備抗重鏈血清,F(ab)2，常作為抗體試劑用于試驗(yàn),木瓜蛋白酶 （papain),胰蛋白酶 (pepsin),胃蛋白酶 (pepsin),1. 氧化法：優(yōu)點(diǎn)是切開后，肽鏈不能重新 形成二硫鍵、便于肽鏈純化； 缺點(diǎn)是色氨酸側(cè)鏈容易被破

10、壞。,氧化法和還原法評價,返回,2. 還原法：將二硫鍵還原成琉基。但極不 穩(wěn)定，易重新形成二硫鍵，必須及時用 碘乙酸或碘化酰胺進(jìn)行羧甲基化。,純化抗原的鑒定,1.含量鑒定 2.理化性質(zhì)鑒定 凝膠層析技術(shù)測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳 凝膠管狀電泳 超速離心 3.純度鑒定 常用醋酸纖維膜電泳 4.免疫活性鑒定 常用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),純化抗原的鑒定,藍(lán)色,1含量鑒定,在一定范圍內(nèi)，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈直線相關(guān)。,方法：酚試劑法鑒定 主要試劑：磷鉬酸-鎢酸的混合酸 原理：,蛋白質(zhì)中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能,鎢酸、鉬酸,還原,3H2OP20513WO35MoO310H20 和3H2P20514WO3

11、4MoO310H20,絡(luò)合物的雙縮脲法,蛋白質(zhì)Ca2+,堿性,加深,含量鑒定,藍(lán)色,理化性質(zhì)鑒定,已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品,測未知分子量：將樣品在同一凝膠柱上，同一條 件下層析、洗脫、測保留體積，并查出分子量。 此法簡便、樣品用量少，有一定的實(shí)用價值。,凝膠柱,保留體積,分子量的對數(shù),2.理化性質(zhì)鑒定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,凝膠層析技術(shù)進(jìn)行測定,垂直電泳,聚合成大分子凝膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,有分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)及濃縮效應(yīng)，能精 確地分離和鑒定高分子物質(zhì)。,PAG的分子篩效應(yīng)測定蛋白質(zhì)抗原的分子量。 原理：,雙丙烯酰胺 N,N-methylene bisacrylamide,Bis,丙烯酰胺

12、(acrylamide,Acr),催化劑,3. 純度鑒定,方法：醋酸纖維膜電泳進(jìn)行鑒定。,返回,純度鑒定,原理：蛋白質(zhì)在一定pH下都帶有電荷，由于 各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同、分子量也異，因此 所帶電量也各不相同，在外加直流電場的作 用下，它們泳動的速度不同，經(jīng)一段時間后 即可彼此分開，形成電泳譜；從而判斷蛋白 質(zhì)抗原的純度。,特點(diǎn)：快速簡便。,三、半抗原免疫原的制備,1.半抗原：低分子量的化學(xué)物質(zhì)。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、 某些藥物(包括抗生素）及其他化學(xué)物品等。,三、半抗原免疫原制備,2.載體：蛋白質(zhì)類 多肽聚合物 大分子聚合物,3.半抗原-載體連接方法:,載體類型,1

13、.蛋白質(zhì)：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。,載體類型,2.多肽聚合物：人工合成的，常見的有多聚賴 氨酸，其分子量大（可達(dá)十幾萬到幾十萬)， 這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激免疫動 物產(chǎn)生高效價、高親和力的抗體。,3.大聚合物：羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可與半抗原結(jié)合，加入弗氏完全佐劑亦 可誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體。,半抗原-載體連接方法1,碳化二亞胺法：,R-NH=CH-R,半抗原載體蛋白質(zhì),攪拌12h,室溫24h,透吸除去未反應(yīng)的半抗原,人工免疫原,半抗原載體連接方法1,混合,混合,半抗原-載體連接方法2,戊二醛法:,半抗原-NH2,載體蛋白-NH2,半抗原-N

14、=CH-(CH2)3-CH=NH-載體蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的帶有兩個活性基團(tuán)的雙 功能聯(lián)接劑,半抗原載體連接方法2,半抗原-載體連接方法3,氯甲酸異丁脂法：,半抗原-COOH,載體蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-載體蛋白,半抗原載體連接方法3,簡便，用于類固醇抗原制備,HO-CH2CH(CH3)2,半抗原-載體連接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,帶羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-

15、COOH,返回,吡啶,再經(jīng)氯甲酸異丁脂法或碳化 二亞胺法制備載體半抗原,半抗原載體連接方法4,四、佐劑,* 概念：與抗原同時或預(yù)先注射于機(jī)體，能增 加機(jī)體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。,四、佐劑,條件：增加抗原的表面積； 改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型； 佐劑與抗原混合能延長抗原在局部 組織的存留時間； 可直接或間接激活免疫活性細(xì)胞； 無毒性或無副作用。,（二）常用佐劑的種類和制備,1.氫氧化鋁佐劑：,5%硫酸鋁,5%氫氧化鈉,氫氧化鋁沉淀,制成懸液 即為佐劑,強(qiáng)烈攪拌,NS洗 二次,NS,等體積抗原,免疫接種,（二）常用佐劑的種類和制備,2.明礬佐劑,10%硫酸鉀鋁,氫氧化鈉校正pH值至6.5,

16、沉淀,乳狀懸液,* 明礬佐劑抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽種和膿腫。,NS攪拌,NS洗 二次,離心,抗原,備用,防腐劑,作用大于不完全佐劑 局部形成肉芽種和潰瘍 不能用于人體,弗氏完全佐劑,3.弗氏佐劑(Freund adjuvant),液體石蠟,完全乳化,備用,高壓 滅菌,加熱,抗原,弗氏不完全佐劑,卡介苗,羊毛脂,鑒定,一滴 乳劑,乳劑不散浮于液面,水中,混合,4.佐劑應(yīng)用原則和評價,目的:增強(qiáng)抗原對機(jī)體的免疫原性； 增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生能力； 為制備出高效價的免疫血清； 增強(qiáng)可溶性抗原的免疫原性； 在某種情況下，改變Ag免疫應(yīng)答類型； 延長抗原在免疫動物的時間； 改變抗原的分布；

17、增強(qiáng)局部對變應(yīng)原的超敏反情況；,4.佐劑應(yīng)用原則和評價,應(yīng)用佐劑的缺點(diǎn), 佐劑?；煊形⒘科渌镔|(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn) 入體內(nèi)后也可引起抗體的產(chǎn)主，影響抗 血清的特異性；,應(yīng)用佐劑的缺點(diǎn), 注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌 性膿腫；, 反復(fù)注射，易發(fā)生超敏反應(yīng)，使局部組 織壞死，甚至引起動物死亡。,第二節(jié) 免疫血清的制備,1.免疫動物選擇 2.免疫方法 3.動物采血法 4.免疫血清的分離及保存,一、免疫動物選擇,能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。 兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。,一、免疫動物選擇,1.抗原與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)越好；,2.動物必須適齡、健壯、無感染的正常動物、 體重合乎要求；,3

18、.不同動物種類對同一免疫原有不同的免疫 應(yīng)答；,4.按需要量選擇大小不同的動物。,二、免疫方法,3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐劑1月 抗原 混合免疫法：綜合皮下、淋巴結(jié)和靜脈,二、免疫方法,1.免疫原的注射劑量,2.免疫途徑：免疫反應(yīng)產(chǎn)生速度依次為靜脈 腹腔肌肉皮下皮內(nèi)淋巴結(jié)足掌,三、動物采血法,1.頸動脈放血法：最常用的方法 2.心臟采血法：要求操作熟練 3.靜脈采血法：,1.4保存：可保存36個月 2.低溫保存：-20-40，可保存23年 3.冰凍干燥保存：可保存35年,三、動物采血法,四、免疫血清的分離和保存,第三節(jié) 抗體的純化和鑒定,1.抗體特異性的純化 2.特異性IgG類抗體的純化 3.特異性抗體的鑒定,一、抗體特異性的純化,1.親合層析法：將交叉抗原交聯(lián)到Sepharose 4B上，裝柱后，將預(yù)吸收的抗體通過親合層 析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液