1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件,一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng) 器材的清洗和消毒 器材的清洗 浸泡、刷洗、泡酸、沖洗 器材的消毒滅菌 物理消毒 化學(xué)消毒,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和制備,水和平衡鹽溶液 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 無(wú)血清培養(yǎng)基,水：三蒸水或超純水 平衡鹽溶液（BSS） 主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖組成，具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。 例如：Hanks液 注：酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為pH值的指示劑： 中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。,BSS的用途,洗滌組織細(xì)胞 基礎(chǔ)溶液 維持正常的滲透壓及pH值 提供能量,BSS的配制,一般使用三蒸水配制 配制好的液體呈桃紅色，沒(méi)有渾濁和沉淀。 要

2、避免鈣離子，鎂離子沉淀，單獨(dú)溶解。 滅菌后要補(bǔ)充一定的水分 如有沉淀或渾濁，應(yīng)重新配制。,動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類(lèi)和組成,分3類(lèi): 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 無(wú)血清培養(yǎng)基,（1）天然培養(yǎng)基 動(dòng)物血清（胎牛血清、小牛血清）、組織提取液、雞胚胎汁等。 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高 缺點(diǎn)：成分復(fù)雜、來(lái)源有限、成本較高 血清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過(guò)血凝或去纖維蛋白法)的血漿。,血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)： 含有豐富的利于細(xì)胞生長(zhǎng)的成分 血清培養(yǎng)基缺點(diǎn)： （1）動(dòng)物血清來(lái)源有限，價(jià)格高，不宜大量使用 （2）動(dòng)物血清成分復(fù)雜且成分不穩(wěn)定，使生長(zhǎng)過(guò)程不易檢測(cè)控制。 （3）雖然血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有效，但會(huì)對(duì)后期培養(yǎng)產(chǎn)物的分

3、離、提純以及檢測(cè)造成一定困難。,血清的生物功能,1.提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、 維生素、無(wú)機(jī)物、脂類(lèi)物質(zhì)、 核酸衍生物等，是細(xì)胞生長(zhǎng) 必須的物質(zhì)。,2.提供激素和各種生長(zhǎng)因子：胰島素、腎上腺 皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類(lèi)固醇 激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長(zhǎng)因子如 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板 生長(zhǎng)因子等。,3.提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的 低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、 以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì) 胞代謝過(guò)程中起重要作用。,4.對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用： 提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。 有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣

4、細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。可以使用血清來(lái)終止胰蛋白酶的消化作用。因?yàn)橐鹊鞍酌敢呀?jīng)被廣泛用于貼壁細(xì)胞的消化傳代。,血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時(shí)，粘度起到重要作用。 血清還含有一些微量元素和離子，他們?cè)诖x解毒中起重要作用,合成培養(yǎng)基, 優(yōu)點(diǎn)：成分已知，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行控制。 缺點(diǎn)：無(wú)法替代一些未知成分 解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補(bǔ)，成為“完全培養(yǎng)基” 目前常用的合成培養(yǎng)基包括：MEM、DMEM、 F12、M199等。,MEM培養(yǎng)基：厄爾利（Earle）于1951年開(kāi)發(fā)成功 。含有少量氨基酸、維生素、谷氨

5、酰胺以及必須的 無(wú)機(jī)鹽，組成簡(jiǎn)單。 DMEM培養(yǎng)基：由杜爾貝科（Dulbecco）等在 MEM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上研制而成，增加了各已有成分的 含量，同時(shí)又根據(jù)葡萄糖高低分為高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型適合生長(zhǎng)較快、貼附性差的細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞）培 養(yǎng)。,氨基酸：培養(yǎng)基提供必需的12種氨基酸 維生素：B族維生素 糖類(lèi)：大多以葡萄糖為碳源 無(wú)機(jī)鹽 其它成分：嘌呤，嘧啶以及抗氧化劑,無(wú)血清培養(yǎng)基 提高重復(fù)性 減少微生物污染 供應(yīng)充足穩(wěn)定 產(chǎn)品易純化 避免血清因素對(duì)細(xì)胞的毒性 減少血清中蛋白對(duì)生物測(cè)定的干擾,無(wú)血清培養(yǎng)基(Serum free medium,SFM)是不

6、含血清的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加組分組成。試圖全部替代血清成分。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基較常用的是DMEM、F12培養(yǎng)基。,無(wú)血清培養(yǎng)基加入添加劑 生長(zhǎng)因子和激素 結(jié)合蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白和白蛋白 貼附因子和伸展因子 有利細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素,獲得細(xì)胞,細(xì)胞的全能性,植物體,培養(yǎng)結(jié)果,或細(xì)胞產(chǎn)物,快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等,培養(yǎng)目的,葡萄糖、動(dòng)物血清,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質(zhì),細(xì)胞增殖,原理,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項(xiàng)目,植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,細(xì)胞群體,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需的基本條件,細(xì)胞體外培養(yǎng)基本條件: 無(wú)菌 營(yíng)養(yǎng)充足,防止有害物質(zhì) 氧氣 隨時(shí)

7、清除代謝有害物質(zhì) 良好的生存外環(huán)境 及時(shí)分種,影響動(dòng)物細(xì)胞體外生長(zhǎng)的因素包括生物因素、化 學(xué)因素、物理因素。生長(zhǎng)條件的控制主要包括溫 度、pH、滲透壓、氣體等。 ,溫度：人類(lèi)和哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜溫度為 36.55，。 pH：哺乳動(dòng)物細(xì)胞為7.1-7.3。 滲透壓：細(xì)胞在高滲透壓或低滲透壓溶液中會(huì)發(fā) 生皺縮或腫脹，甚至破裂。（BSS溶液） 氣體：細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝離不開(kāi)氣體，主要包括O2 和CO2。二氧化碳培養(yǎng)箱。,第十二章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長(zhǎng)條件，模擬體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長(zhǎng)與增殖的技術(shù)。,原代培養(yǎng),由機(jī)體取得材

8、料培養(yǎng)到第一次傳代前即為原代培養(yǎng)，也稱為初始培養(yǎng)。 取材 解離釋放細(xì)胞 原代培養(yǎng)常用方法,取材,雞胚組織 鼠胚組織 血細(xì)胞 人體腫瘤,解離釋放細(xì)胞,消化法,機(jī)械法,一般體積稍大的組織在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)時(shí)，處于周邊的少量細(xì)胞生長(zhǎng)較好，而大部分內(nèi)部細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)穿透有限而代謝不良，同時(shí)會(huì)受到纖維成分束縛。因此，為獲得大量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，必須把組織分散，使細(xì)胞解離。,為什么要把動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行解離？,消化法,消化法是用酶或螯合劑把已經(jīng)剪成較小體積的組織進(jìn)一步分散，使其成為小細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)的方法。 胰蛋白酶消化法 膠原酶消化法 其他消化酶消化法 螯合劑消化法,消化液 胰蛋白酶溶液 主要作用是使細(xì)胞間的蛋

9、白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開(kāi)來(lái) 常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。,(2) EDTA溶液 作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。 對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶 (3)膠原酶溶液 膠原酶在上皮類(lèi)細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。,胰蛋白酶消化法,適用于消化間質(zhì)較少的軟組織 鈣離子和鎂離子對(duì)胰蛋白酶的活力有一定抑制作用，因此一般不用含有這些離子的BSS配制。 胰蛋白酶的消化效果影響因素。 胰蛋白酶消化法有熱和冷兩種不同的處理?xiàng)l件。,胰蛋白酶消化法,機(jī)械法,離

10、心分離法 機(jī)械解離法,針芯擠壓過(guò)網(wǎng)法,針頭抽吸法,原代培養(yǎng)常用方法,組織塊培養(yǎng)法 單層細(xì)胞培養(yǎng)法 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法,1、組織塊培養(yǎng)法：將體內(nèi)取出的組織塊切割成一定大小的植塊后再接種進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 為什么組織塊培養(yǎng)法能用于培養(yǎng)細(xì)胞？ 對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物組織而言，在植塊培養(yǎng)13天 后，即有細(xì)胞從植塊向外遷移，隨著培養(yǎng)時(shí)間 的推移，遷出的細(xì)胞會(huì)越來(lái)越多，而且遷出的細(xì)胞不斷分裂繁殖，逐漸漲滿支持物表面,組織塊培養(yǎng)法,使用組織塊培養(yǎng)法，外植塊能在一定限度內(nèi)保持其原有的組織結(jié)構(gòu)，有利于適應(yīng)外界培養(yǎng)環(huán)境，操作簡(jiǎn)便，是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中最常用的原代培養(yǎng)方法。,動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng),組織塊法,細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品,細(xì)胞

11、培養(yǎng)瓶 25平方厘米，正方斜頸 25平方厘米，三角斜頸 75平方厘米，正方斜頸 75平方厘米，三角斜頸 150平方厘米，正方斜頸,細(xì)胞培養(yǎng)板 6孔， 12孔， 24孔， 48孔 96孔,細(xì)胞培養(yǎng)皿 35mm 60mm 100mm,凍存管 1.2ml 2ml， 5ml,超凈工作臺(tái)與生物安全柜,首先超凈工作臺(tái)是一種局部?jī)艋O(shè)備，即利用空氣潔凈技術(shù)使一定操作區(qū)內(nèi)的空間達(dá)到相對(duì)的無(wú)塵、無(wú)菌狀態(tài)。它的主要作用在于給與實(shí)驗(yàn)一個(gè)幾乎無(wú)菌的環(huán)境；,生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來(lái)保護(hù)操作者本人、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于上述操作過(guò)程中可能產(chǎn)生的感染性

12、氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的。使用安全柜的目的是為了給微生物及動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等特殊培養(yǎng)的環(huán)境。,從流程上簡(jiǎn)單來(lái)講就是先在超凈工作臺(tái)獲得目的制品后，然后再轉(zhuǎn)移到生物安全柜里培養(yǎng)。,無(wú)菌室,液氮罐,安全柜,液氮罐,著裝,操作者進(jìn)入無(wú)菌室前先用肥皂洗凈雙手，然后用1 新潔爾滅浸泡消毒5分鐘,將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1 新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無(wú)菌室。,將小白鼠置超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)腹腔,用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門(mén)，去腎外膜及脂肪。,剪碎組織,接種組織塊,移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），,靜止23小時(shí)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。,觀察,2448小時(shí)后若培養(yǎng)液

13、變成黃色且混濁，表示已被污染； 若培養(yǎng)液變成紫色，一般細(xì)胞生長(zhǎng)不好，則培養(yǎng)液pH過(guò)高；,若培養(yǎng)液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時(shí)見(jiàn)細(xì)胞自組織邊緣長(zhǎng)出。 繼續(xù)培養(yǎng)35日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長(zhǎng)相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)34天，細(xì)胞貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁時(shí)便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。,單層細(xì)胞培養(yǎng)法,將體內(nèi)取出的組織塊制備成單細(xì)胞懸液后再接種進(jìn)行培養(yǎng)的方法，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴型細(xì)胞,就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長(zhǎng)而形成細(xì)胞單層，所以這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)法，又稱為組織塊消化培養(yǎng)法。,單層細(xì)胞培養(yǎng)法,懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法,懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞

14、懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)增殖的培養(yǎng)方式。 少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有貼壁依賴性，可通過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長(zhǎng)，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)。 適用于血液和淋巴組織的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等非貼壁依賴性的動(dòng)物細(xì)胞。,傳代培養(yǎng),將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)。 原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足或細(xì)胞密度過(guò)大導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。,動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)特性：,細(xì)胞貼壁： 懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上， 稱為細(xì)胞貼壁。 要求： 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。 細(xì)胞的接觸抑制： 當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相

15、互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代必須采用消化法。 根據(jù)細(xì)胞貼壁牢靠程度的不同，可以選用不同的消化液。 必要時(shí)還可聯(lián)合使用消化液。,半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代,此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打方法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。 直接吹打會(huì)造成一些細(xì)胞的損傷。,懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代,懸浮細(xì)胞多采用離心法傳代。,動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,胰蛋白酶,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,制成,細(xì)胞懸浮液,原代培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞增殖,部分細(xì)胞無(wú)限傳代,去掉組織間蛋白,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能 最終培養(yǎng)成生物體,傳代培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官,細(xì)胞懸浮液,胰蛋白酶,10代細(xì)胞,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),無(wú)限傳代,單個(gè)細(xì)胞,加培養(yǎng)液,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,（分解彈性纖維）,細(xì)胞系與細(xì)胞克隆,細(xì)胞系的建立 細(xì)胞克隆技術(shù) 克隆的分離,細(xì)胞株：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到4050代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。,細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只