1、基因工程工具酶,Made by lionchp,一 概述,核酸酶 定義：水解磷酸二酯鍵，使核苷酸鏈斷裂的 蛋白酶 分類： DNase：水解DNA的核酸酶 RNase：水解RNA的核酸酶 外切酶：從核酸分子末端一個接一個降解核苷酸 內(nèi)切酶：從核酸分子內(nèi)部切割，使核苷酸分子斷成 小片段,細菌的R-M體系： 定義：限制-修飾體系，細菌可識別自身DNA 和外源DNA，降解外源DNA對外源DNA 有抵抗力 原理：修飾酶從SAM（s-腺苷甲硫氨酸）上轉(zhuǎn) 移甲基到特定識別位點的特定堿基上，使DNA 甲基化，保證內(nèi)源DNA不被限制酶降解 生物意義：保證內(nèi)源DNA不被限制酶降解，快速降解未被甲 基化的外源DNA

2、 DNA復制過程中的甲基化：模板鏈是甲基化的，使子代DNA （半甲基化）不被限制酶降解，甲基化酶再將新合成鏈甲基 化，使子代DNA完全甲基化，防止被內(nèi)切酶降解,二 限制性內(nèi)切酶（限制酶）,命名：酶來源的微生物 屬名：第一個字母 種名：前兩個字母 株名：abcd 該株中該酶編號：某株微生物中可能編碼了 多種內(nèi)切酶 例：Haemophilus influenzae的d株中發(fā) 現(xiàn)的第種內(nèi)切酶-Hind,限制酶識別位點特征： 專一性 大多有4-8bp：主要是6bp的，富含CG 大多為回文序列：反向重復序列,易切割出粘 性末端片段 切割位點在識別序列內(nèi)：識別位點甲基化不 利于切割,ATCG AT TA

3、GCTA,限制酶識別序列出現(xiàn)幾率及酶切片段估算,假設：四種堿基出現(xiàn)概率相同（實際上CG 出現(xiàn)概率比AT大，但無影響） 一般酶切識別序列6bp：每46=4096個核苷酸中酶切位點有一次出現(xiàn)機會 內(nèi)切酶識別序列出現(xiàn)幾率：1/4096（每4096個核酸酶中出現(xiàn)一次） 長49000bpDNA中有：12個內(nèi)切酶識別位點 （49000/4096）,切割方式： 成黏性末端：切割位點在識別序列中心軸兩 側(cè) 3黏性末端：3末端比5長 5黏性末端：5末端比3長 成平齊末端：切割位點在識別序列中心軸處 切割位點的標記：、/,同位酶、同裂酶與同尾酶 同位酶： 同裂酶：來源不同，但有相同的識別序列， 切割DNA后產(chǎn)生相

4、同末端的一組限制 酶 同尾酶：來源不同，識別序列也不同，但切 割DNA后產(chǎn)生相同末端的一組限制酶,酶活影響因素 DNA純度：雜質(zhì)會降低酶活 DNA甲基化：DNA甲基化后穩(wěn)定，不易切割 DNA分子結(jié)構(gòu)：線性DNA易切，超螺旋難切； CG多難切 星活性： 酶的特異性改變而呈現(xiàn)的活性,緩沖液： 時間與溫度：t=1-1.5h;T=37OC 反應體積與甘油濃度：保存時50%甘油防凍 融，反應時50%；酶體積在總反應體積1/10 以內(nèi)，防酶活被抑制；反應體積：20-100ul 酶活單位定義：,示例：典型的切反應酶,三種限制酶,型： 不適用于基因工程。只在腸道 菌中發(fā)現(xiàn) 型： 基因工程的工具酶 型： 切割位

5、點不在識別位點，一般離識別位點25 bp27 bp，對分子克隆操作亦無實用意義,三 DNA連接酶,作用機理：利用NAD+或ATP能量，催化多段 DNA3-OH與5-P成3，5-磷酸二 酯鍵 步驟：酶+AMP+ATP酶-AMP+ADP酶-AMP-P-DNA酶+AMP+DNA-P-DNA 特點： 能量來源：所有真核生物的DNA連接酶都是利 用ATP提供能量。細菌的DNA連接酶都是依賴 NAD+的。只修復切口，不修復缺口,分類 T4DNA連接酶： 可連接雙鏈DNA片段的平齊末 端、黏性末端 大腸桿菌DNA連接酶：NAD+供能，只連接黏性 末端,反應條件： T：16oC原因：溫度37OC最宜，但溫度過

6、高會氫鍵斷裂 緩沖液：Tris-HCl50-100mmol/L維持pH穩(wěn)定 MgCl2：10mmol/L，激活劑 ATP：0.5-1 PTT：5mmol/L，巰基試劑，防被氧化 pH：7.5 V：10-20uL t：4-16h 酶活單位：1IU=最適條件下，15oC反應1h，完全連接 1ugDNA所需酶量,四 DNA聚合酶（DNAPol）,定義：催化以DNA或RNA為模板合成DNA的 一類酶 特點：將四種dNTP連續(xù)加到雙鏈DNA的引 物鏈3-OH末端上，催化核苷酸聚 合，形成新DNA鏈DNAPol在DNA鏈 與核苷酸（dNTP）之間,分類 大腸桿菌DNAPol： 三活性：53聚合，35外切，

7、53外切 35外切：校正 53外切：切除突變DNA、引物 反應條件：,應用：缺口平移制探針、 3-粘端的末端標記 合成cDNA的第二鏈,切口移位法標記DNA,在DNase的作用基礎上產(chǎn)生鏈內(nèi)切口，應用此 酶的53聚合酶活性和53外切核酸酶活 性的同步聯(lián)合反應，使切口沿DNA鏈從5-端 向3-端移動。若用于聚合反應的原料dNTP帶 有放射性核素32P，就能使生成的雙鏈帶有 標記物,3-粘端的末端標記,先利用此酶的35外切核酸酶活性，切除凸 出的3-粘端，形成5-凸出粘端；再以其 53聚合酶活性使其補平，在高濃度的dNTP 條件下，使3-端的外切反應與dNTP的攙人反 應達到平衡。若dNTP中有放

8、射性標記的核苷 酸，即可使產(chǎn)物成為3-末端帶標記的DNA。,Klenow： 定義：DNAPol被木瓜蛋白酶水解成的2/3大 亞基 酶活：53聚合，35外切 應用：隨機引物標記核酸探針、5-粘端補平 或3端標記、合成cDNA的第二鏈、DNA 序列分析、3-端的末端標記,T4DNAPol： 定義：T4噬菌體中發(fā)現(xiàn)的，可標記平齊末端 的DNA聚合酶 兩活性：53聚合，35外切（對單鏈DNA 作用更強） 基因工程中的作用：平齊末端標記，3末端 隱蔽,T7DNAPol： 特點：持續(xù)合成能力最強 酶活： 53聚合，35外切 應用：引物延伸、雙脫氧終止法對長DNA測序,反轉(zhuǎn)錄酶： 基礎知識：見分子生物學，以RNA為模板，生 成無內(nèi)含子的cDNA 分類：AMV-逆轉(zhuǎn)錄酶： Mo-MLV-逆轉(zhuǎn)錄酶： 應用：,TaqDNAPol： 耐高溫：最適溫度7580，95可維持活 性40min用于PCR 無35外切校正活性：PCR循環(huán)次數(shù)太多會 導致DNA損傷積累 激活劑：Mg2+，低濃度Mn2+中也有活性 抑制劑：Ca2+,反應條件 Tris-HCl：維持pH7.5 Mg2+：激活劑 EDTA：使DNase去激活，防止DNA被水解,五 RNA聚合酶,六 其它DNA修飾酶,堿性磷酸酶：切去5磷酸,核酸外切酶：,S1核酸酶：降解ssDNA、ssRNA，對ssDNA活 性高 作用：切ssDNA成平齊末