1、GFP的簡介和應用【摘要】源于多管水母屬等海洋無脊椎動物的綠色熒光蛋白（GFP），是一種極具應用潛力的標記物，有著極其廣泛的應用前景。本文就GFP的理化性質、熒光特性、改進以及它在科學研究中發(fā)揮的作用進行了綜述?！娟P鍵詞】綠色熒光蛋白（GFP）、標記物、熒光特性、進展、改進、應用、干細胞移植【正文】一、GFP的簡介1. GFP的理化性質，熒光特性及其改進1.1 GFP的理化性質從水母體內分離到的GFP基因，長達2.6kD，由3個外顯子組成，分別編碼69、98和71個氨基酸。GFP本身是一種酸性，球狀，可溶性天然熒光蛋白。Aequoria GFP分子量約27103，一級結構為一個由238 個氨基

2、酸殘基組成的單鏈多肽；而Renilla GFP是分子量為54kD的同型二聚體。兩種GFP有不同的激發(fā)光譜，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰為473 nm；Renilla GFP在498 nm具有強烈的光吸收，肩峰為470 nm。兩種GFP含有相同的生色團，發(fā)射光譜基本相同（max= 508 509 nm）。GFP性質極其穩(wěn)定，易耐受高溫處理，甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光性質。其變性需在90或pH12.0的條件下用6mol/L鹽酸胍處理，一旦恢復中性環(huán)境，或去除變性劑，雖然變性的蛋白質并不能完全復性，但是復性蛋白質同天然蛋白質對溫度、pH變化的耐受性、抗胰蛋白酶消解

3、的能力是相同的。更重要的是，它們在很大的pH范圍內的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。Renilla GFP的穩(wěn)定性就更為顯著。它在上述一系列的變性條件下都很穩(wěn)定，不易變性。根據Sheen等的研究，GFP在受體內表達時，其穩(wěn)定性并不亞于CAT 蛋白，因而可以得到持續(xù)時間較長的熒光。1.2 GFP的熒光原理GFP的性質和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性是同其生色團結構的穩(wěn)定性密不可分的。GFP表達后折疊， 在氧存在的條件下，使66位氨基酸殘基的、鍵間脫氫。由65 67位的氨基酸殘基（Ser- Tyr Gly）環(huán)化為穩(wěn)定的對羥基苯咪唑啉酮（4- p- hydroxybene- 5- imidazolinone），形成生色

4、團（基于組成生色團的元件不同，可將已知的GFP及其變種分為7種，每一種都有一組不同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長)。GFP無需再加任何底物和輔助因子，在紫外或藍光激發(fā)下就能發(fā)熒光，在450 490nm藍光激發(fā)下，GFP熒光至少能保持10min以上，不像其他熒光素，熒光容易淬滅。其中，GFP的一個引人注目的特點，其生色團的形成沒有物種的特異性?？梢栽诜g后2 4h通過自動催化作用來合成。Cubitt 等認為生色團自身環(huán)化的驅動力來自蛋白質三維結構的形成，由此Kolb等提出一個假說， 即環(huán)化在新合成的多肽的折疊過程中進行。1.3 GFP的熒光性質及應用優(yōu)點GFP的熒光性質比較特殊，具有諸多優(yōu)點而備受關注。（

5、1）易于檢測，靈敏度高。GFP熒光反應不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到。其次， 即便是未經純化的GFP發(fā)射的綠光也是相當強的，在正常室內光線下仍清晰可辨。對于單細胞水平的表達也可識別。（2）熒光性質穩(wěn)定。GFP對光漂白（一種熒光衰減現象）有較強的耐受性，能耐受長時間的光照，從而延長了可探測時間； GFP在pH7 12范圍內也能正常發(fā)光，對高溫（70 ）、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數普通酶都有較強抗性。（3）對細胞無毒害。從目前的研究結果來看，GFP對生活的細胞基本無毒害，與目的基因融合后，對目的基因的結構功能沒有影響，轉化

6、后細胞仍可連續(xù)傳代。（4）構建載體方便。由于編碼GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起構建多種質粒，而不至于使質粒過大影響轉化頻率。（5）可直接用于活細胞測定。GFP 是能在異源細胞內表達后，能自發(fā)產生熒光的蛋白，并且GFP的分子量較小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的標記物，可進行活細胞實時定位觀察，更能接近自然真實的狀態(tài)。如在活細胞中直接觀察蛋白向細胞核、內質網運動的狀態(tài)，還可實時觀察到外界信號刺激下，目的蛋白的變化過程，借助熒光顯微鏡觀察，使研究更為方便。使用激光共聚焦顯微鏡，其圖像效果更佳，結合現代的計算機軟件，可進行三維顯示。（6）不受假陽性干擾。由于其他生物本身

7、不含有GFP，因此不會出現假陽性結果，GFP作為分子探針可以代替熒光染料，避免由于染料擴散造成的定位不準，使結果真實可靠。（7）廣譜性。表現在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達，其次是GFP沒有細胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達發(fā)出熒光。（8）易于得到突變體。如GFP中氨基酸的替換可產生不同光譜特性的突變體，且增強了熒光強度，適合在不同物種中專性表達。1.4 GFP的改進盡管GFP作為報告基因或分子探針有許多無可比擬的優(yōu)點，但是野生型GFP（wtGFP）具有一定的缺點：如GFP有兩個激發(fā)峰影響了其特異性，并且長波激發(fā)峰強度較小，不易觀察；GF

8、P合成及折疊產生熒光的過程慢，蛋白質折疊受溫度影響大，表達量較低；而且在某些植物細胞中并不表達。這些都限制了進一步的應用，所以，一些研究人員運用定點突變、DNA- shuffling 等技術對GFP進行了改進，獲得了熒光光譜、量子產率、溶解性、密碼子嗜性、溫度敏感性等改變的多種突變體，擴大了GFP的應用范圍。2. GFP的應用GFP的應用主要集中在利用其熒光性質的基礎上作為一種標記物。2.1 GFP在分子生物學上的應用2.1.1 GFP作為報告基因報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的DNA，如傳統(tǒng)的熒光素酶（LUX）基因和-葡萄糖苷酶（GUS）基因。GFP作為基因報告可用來檢測轉基因效率，

9、把GFP基因連接到目的基因的啟動子之后，通過測定GFP的熒光強度就可以對該基因的表達水平進行檢測。目前，此方法無論在農桿菌介導或基因槍介導的植物遺傳轉化中還是在活細胞、轉基因胚胎和動物中都已得到非常廣泛的應用，特別是在活細胞基因表達的時空成像方面。2.1.2 GFP作為融合標簽GFP最成功的一類應用就是把GFP作為標簽融合到主體蛋白中來檢測蛋白質分子的定位、遷移、構象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標記某些細胞器。在多數情況下，GFP基因在N-或C-末端與異源基因用常規(guī)的分子生物學手段就可以接合構成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達產物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現出與天然GFP相似的熒光特

10、性。GFP的這種特性為蛋白質提供了一種熒光標記，不僅可以檢測蛋白質分子的定位、遷移，還可以研究蛋白質分子的相互作用以及蛋白質構象變化，并依靠熒光共振能量轉移即FRET 來進行檢測。2.2 作為生物傳感器2.2.1 檢測pH野生型GFP和其許多突變體都具有依賴于pH的熒光變化，因而可以被用來檢測活細胞內的pH。人們通常稱它們?yōu)镻hluprin。分為兩類：比率Phluorin和盈缺Phluorin。當pH降低時，比率Phluorin的最大激發(fā)波長從395 nm到475 nm遷移，利用兩個最大波長處的熒光強度的比率可以測量pH；當pH值小于6時，盈缺Phluorin在475nm處沒有熒光。當pH回復

11、到中性時，兩類Phluorin都會在20 ms內復原。Hanson等在2002年就設計了一系列GFP突變體deGFP，作為雙波長比率測量的pH探針，用于細胞內檢測。2.2.2 檢測鹵素離子YFP（H148Q）變體不但對pH敏感而且對不同離子也同樣敏感，故可以用來檢測亞細胞結構中鹵素離子的濃度和傳遞。2.2.3 其他檢測應用另外，GFP可以應用于檢測電位、氧化還原水平以及在信號轉導中作為Ca2+指示劑。2.3 GFP在細胞生物學上的應用GFP具有同宿主蛋白構成融合子的性質，利用這一性質，可以將GFP定位到特定的細胞器和膜系統(tǒng)中，進行細胞生理過程、細胞動力學等的實時觀測，或直接應用于定量分析。目前

12、，GFP已經被成功地用于靶向標記包括細胞核、線粒體、質體、內質網等在內的細胞器。用GFP進行亞細胞定位，避免了提純蛋白、標記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經顯微注射或其他方式導入細胞的復雜方法，從而使研究蛋白在活細胞的準確定位變得簡單易行。2.4 GFP在篩選方面的應用2.4.1 GFP用于細胞的篩選基于GFP的熒光特性，并且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便，GFP在細胞篩選上得到應用廣泛。Yuk等使用GFP作為標記能快速篩選出在生長抑制環(huán)境下，仍能保持重組蛋白大量表達的CHO細胞。2.4.2 GFP用于藥物的篩選利用GFP對目的物進行標記，追蹤GFP，分析目的物在細胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)

13、、生物活性、受體、離子通道等變化，從而篩選出與體內信號分子功能相似的化合物。二、GFP的應用綠色熒光蛋白標記在干細胞移植中的應用綠色熒光蛋白標記具有很多優(yōu)點，因而被廣泛應用于干細胞移植的研究領域。目前，常用的綠色熒光蛋白標記干細胞的方式有3 種：質粒載體轉染、病毒載體轉染和綠色熒光蛋白轉基因動物。綠色熒光蛋白質粒轉染具有操作簡便、對干細胞的免疫源性和毒性小等優(yōu)點，但不十分穩(wěn)定，容易丟失；病毒載體的優(yōu)勢是表達高效穩(wěn)定，但存在免疫反應和致癌性等安全隱患；從綠色熒光蛋白轉基因動物分離得到的干細胞標記穩(wěn)定，無上述缺點，是最為理想的選擇。目前，綠色熒光蛋白轉基因在小動物中較為成熟，如綠色熒光蛋白轉基因小

14、鼠，而在大鼠等稍大動物中不十分成熟。綠色熒光蛋白標記的干細胞移植后在體內的分布情況可在熒光顯微鏡下直接觀察到，結合使用定量聚合酶鏈反應、激光共聚焦和熒光激活細胞分類計數等技術方法，還可監(jiān)測移植干細胞在體內的分化增生情況以及其在各組織的含量等。分別簡述如下：1.1 監(jiān)測移植干細胞在體內的分布情況關云謙等用質粒pEGFP-N1轉染小鼠胚胎干細胞后，移植入活體大鼠紋狀體內。直至移植后21 d，大鼠腦內可見大量綠色熒光蛋白陽性的移植細胞，表明綠色熒光蛋白質粒轉化胚胎干細胞是移植示蹤的較好方法；而Zhou等將pEGFP-N1質粒標記神經干細胞后移植到PD大鼠的紋狀體，結果發(fā)現移植的神經干細胞可存活，并向

15、致傷的腦組織定向遷移和集聚。Asano 等人用免疫缺陷病毒載體將綠色熒光蛋白基因轉染到獼猴胚胎干細胞，然后將干細胞移植到發(fā)育中的獼猴胚胎中。移植后1個月和3個月，采用針對綠色熒光蛋白的定量聚合酶鏈反應和原位聚合酶鏈反應，發(fā)現移植的胚胎細胞廣泛地分布在獼猴胚胎各組織內。Yagi等從綠色熒光蛋白轉基因小鼠分離培養(yǎng)了造血干細胞，然后將其移植到Twither小鼠（一種腦部脫髓鞘損傷動物模型）腦部。移植后一定時間，熒光顯微鏡下可有效地監(jiān)測移植細胞的分布情況， 他們發(fā)現移植的細胞遍布整個腦部，但在脫髓鞘區(qū)較多。類似的，Hill 等將從綠色熒光蛋白轉基因小鼠分離的骨髓移植到大腦中動脈閉塞的小鼠腦內后，可發(fā)現

16、在缺血的腦組織區(qū)域有大量的綠色熒光蛋白陽性細胞集聚。1.2 定量移植干細胞在體內各組織的含量Devine等將綠色熒光蛋白反轉錄病毒載體轉染的骨髓間充質干細胞經靜脈移植到亞致死劑量射線照射的狒狒和正常狒狒體內，聯合使用熒光激活細胞分類計數法、針對綠色熒光蛋白序列的定量聚合酶鏈反應等方法，他們發(fā)現移植的骨髓間充質干細胞可廣泛地分布到各組織； 但和正常狒狒相比，移植到放射損傷狒狒體內的細胞可相對較多地分布到骨髓和胃腸道等放射敏感器官?；|細胞源性細胞因子-1與其受體CXCR4之間的相互關系在造血干細胞歸巢和動員入血中發(fā)揮重要作用，Kahn等構建了人CXCR4-綠色熒光蛋白的融合蛋白慢病毒表達載體，然

17、后采用針對綠色熒光進行熒光激活細胞分類計數定量分析轉染此載體的造血干細胞移植后在骨髓和脾臟中的含量。結果表明，轉染此載體的造血干細胞在骨髓和脾臟中的含量明顯高于沒有轉染的造血干細胞。1.3 檢測移植干細胞在體內的分化情況通常是通過熒光組織化學輔以激光共聚焦顯微鏡觀察，或結合使用非熒光免疫組織化學和熒光顯微鏡觀察實現。采用這種方法，人們發(fā)現，移植的骨髓細胞或骨髓間充質干細胞可分化為肝細胞、肺臟上皮細胞、纖維成肌細胞和腎小管上皮細胞、腎小球細胞和腎小球系膜細胞，參與損傷組織的修復；而移植的神經干細胞可分化為神經元和神經膠質細胞，從而促進損傷的神經功能恢復。1.4 分析干細胞移植后的基因和蛋白表達變化激光捕獲顯微切割技術是1996年由美國國立衛(wèi)生研究院提出的在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細胞群或單個細胞的技術，其工作的基本原理和過程是：在高倍顯微鏡下，觀察520m厚的組織切片，并依據細胞或組織形態(tài)學特征、免疫組化表型，來選擇感興趣的細胞，然后按壓與顯微鏡相連的激光器按紐，激光源發(fā)出一束激光被激光對應部分的透明乙烯乙酸乙烯酯膜吸收，溫度迅速升至90 左右并融化，并在激光脈沖結束200ms內瞬間冷卻，與靶細胞結合，