1、酶標儀的檢測原理 光是電磁波，波長100nm400nm稱為紫外光， 400nm780nm之間的光可被人眼觀察到，大于780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩，是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色，是因為植物吸收了光中的紅色光譜。酶標儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。 檢測單位： 光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系。 檢測單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD1og（1trans），其中trans為檢測物的透光

2、值。根據(jù)Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強度成下述關(guān)系： EOD=log0/其中E表示被吸收的光密度， 0 為在檢測物之前的光強度，為從被檢測物出來的光強度。 OD值由下述公式計算： EOD=CDE C為檢測物的濃度 D為檢測物的厚度 E為摩爾因子 在特定波長下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結(jié)果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。 但是每一種物質(zhì)對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，

3、檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。 Anthos 酶標儀檢測值計算 儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量，轉(zhuǎn)換成二進位數(shù)字信號，最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為 0，沒有檢測物的透光值為100。則實際檢測中，檢測物的透光值均在 0一100之間。透光值 的計算如下： T（MeasMin）（MaxMin） 其中T為透光值， Meas為檢測的二進位數(shù)值， Min為在 0的情況下檢測的二進位數(shù)值， Max為在100的情況下檢測的二進位數(shù)值，舉例如下： MaX=3600 Mn=20 Meas30 T=（30-20）/3600-20)00028 OD1o

4、g（1/T）=1og（1/0.0028）=2.552 Anthos 酶標儀的中心定位 儀器會自動對酶標孔進行中心定位，中心定位是要消除酶標孔底的凸凹引起的厚薄不均帶來檢測的不準確。在對每一個酶標儀進行檢測時，儀器其實要進行35個點的測量，選取最中間的5個點的均值為本孔的OD值。 光源的參照通道 參照通道是用來校準由于電壓不穩(wěn)或燈泡磨損帶來的影響。 酶標儀的用途和其它提示 用于ELISA試劑的測定，廣泛用于各種實驗室，包括臨床實驗室。 質(zhì)量控制 質(zhì)量控制是試劑檢測的重要因素。請按照試劑說明書的要求進行質(zhì)量控制。 空白校正 有一些試劑盒的說陰書將空白孔設(shè)置為空氣，其它大多數(shù)空白孔的設(shè)置是用試劑來設(shè)

5、置的，請按照試劑盒的說明書要求進行。 檢測結(jié)果的解釋 由于有相當多的因素會影響檢測的結(jié)果，如不同的酶標板，檢測試劑的體積，都會造成OD值的不，因此，只有使用同一酶標板反應(yīng)的試劑檢測結(jié)果才能比較和分析。對結(jié)果的臨床解釋請依照試劑盒的說明書進行。 酶標儀的使用注意事項 1、工作環(huán)境 酶標儀是一種精密的光學儀器，因此良好的工作環(huán)境不僅能確保其準確性和穩(wěn)定性，還能夠延長其使用壽命。根據(jù)DIN VDE 0871條例，儀器應(yīng)放置在無磁場和干擾電壓的位置。依據(jù)DIN 45 635 19條例： 儀器應(yīng)放置在低于40分貝的環(huán)境下。 為延緩光學部件的老化，應(yīng)避免陽光直射。 操作時環(huán)境溫度應(yīng)在1540之間，環(huán)境濕度

6、在1585之間。 操作電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。 操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽，煙塵。 保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作空間。 2、操作注意事項 酶標儀的功能是用來讀取酶聯(lián)免疫試劑盒的反應(yīng)結(jié)果，因此要得到準確結(jié)果，試劑盒的使用必須規(guī)范。許多醫(yī)院在使用酶標儀之前是通過目測判斷結(jié)果，操作過程隨意性較大，在使用酶標儀后如果不能及時糾正操作習慣，會造成較大誤差。在酶標儀的操作中應(yīng)注意以下事項： 使用加液器加液，加液頭不能混用。 洗板要洗干凈。如果條件允許，使用洗板機洗板，避免交叉污染。 嚴格按照試劑盒的說明書操作，反應(yīng)時間準確。 在測量過程中，請勿碰酶標板，以防酶標板傳送時擠傷操作人員的手。 請勿將

7、樣品或試劑灑到儀器表面或內(nèi)部，操作完成后請洗手。 如果使用的樣品或試劑具有污染性、毒性和生物學危害，請嚴格按照試 劑盒的操作說明，以防對操作人員造成損害。 如果儀器接觸過污染性或傳染性物品，請進行清洗和消毒。 不要在測量過程中關(guān)閉電源。 對于因試劑盒問題造成的測量結(jié)果的偏差，應(yīng)根據(jù)實際情況及時修改參數(shù)，以達到最佳效果。 使用后蓋好防塵罩。 出現(xiàn)技術(shù)故障時應(yīng)及時與廠家聯(lián)系，切勿擅自拆卸酶標儀。 酶標儀及洗板機選購指南 酶標儀（Microplate Reader）是對酶聯(lián)免疫檢測（ EIA）實驗結(jié)果進行讀取和分析的專業(yè)儀器。酶聯(lián)免疫反應(yīng)通過偶聯(lián)在抗原或抗體上的酶催化顯色底物進行的，反應(yīng)結(jié)果以顏色顯

8、示，通過顯色的深淺即吸光度值的大小就可以判斷標本中待測抗體或抗原的濃度。 酶標儀廣泛地應(yīng)用在臨床檢驗、生物學研究、農(nóng)業(yè)科學、食品和環(huán)境科學中，特別在近幾年中，由于大量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的應(yīng)用，使得酶標儀在生殖保健領(lǐng)域中應(yīng)用越來越廣泛，同時促進了生殖健康技術(shù)水平提高 。目前國內(nèi)許多計生站系統(tǒng)開展了酶免檢測項目，如：乙肝五項、愛滋病檢測、優(yōu)生優(yōu) 育系列檢測、激素檢測等。過去多數(shù)采用目測方法，報出的結(jié)果缺乏科學的依據(jù)。例如：某弓形蟲檢測試劑盒中，臨界值規(guī)定為：陰性對照品的 OD 值2.5，通過目測無法判斷標本孔的反應(yīng)顏色是否超過臨界值。肉眼進行兩孔之間的顏色比較可能還行，但比較一孔的顏色是否超過另

9、一孔顏色的2.5倍就不可能。 國內(nèi)多家權(quán)威機構(gòu)，如衛(wèi)生部臨床檢驗中心和計劃生育系統(tǒng)等多次強調(diào)酶標儀的重要性，并要求酶聯(lián)免疫檢測試劑應(yīng)使用酶標儀判讀，酶免試劑的質(zhì)控也應(yīng)使用酶標儀，并提供酶標儀測定的原始數(shù)據(jù)，而各廠家的試劑盒說明書沒有是讓用目測的。同時酶免檢測的 項目往往是一些實質(zhì)性的感染和病變（如：肝炎、愛滋病、優(yōu)生優(yōu)育等），判讀更要求嚴謹，由誤診引起的糾紛很難處理。另外，住院手術(shù)病人術(shù)前的丙肝、愛滋等 EIA 試劑檢測是避免因輸血引起感染引發(fā)的醫(yī)療事故糾紛的必要手段，正逐漸被許多單位所采用。 我國免疫診斷方法主要有如下三種：酶免（EIA）、放免（RIA）和發(fā)光，在市場上的情況如下： 方法所處

10、市場周期 放免衰退期 酶免成長期 發(fā)光進入期 放免技術(shù)由于試劑的污染和有效期等問題在國際和國內(nèi)市場逐漸被淘汰，而化學發(fā)光試劑和設(shè)備比較昂貴，使得其在國內(nèi)的普及特別在計生系統(tǒng)普及需要較長時間，EIA 技術(shù)穩(wěn)定，試劑價格合理，供應(yīng)充，酶免技術(shù)在中國市場處于成長期，因此購買酶標儀正合適宜。 尤其要提到的是，在中國的計劃生育和婦幼保健系統(tǒng)配備酶標儀已經(jīng)迫在眉睫。早在幾年以前, 世界衛(wèi)生組織已建議對孕婦進行 TORCH五項常規(guī)篩查，但是遺憾的是由于缺乏酶標儀和洗板機等設(shè)備，RCH的檢測在中國還未能普遍開展。TORCH 感染在圍產(chǎn)醫(yī)學中稱為TORCH綜合癥，由于孕婦, 胎兒和新生兒都易被感染, 它已受到全

11、世界婦產(chǎn)科和兒科的極大重視。妊娠期感染不僅危害母體，往往還可對胎兒和新生兒產(chǎn)生嚴重影響。通過胎盤可引起子宮內(nèi)感染而導致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或胎兒生長遲緩和畸形，通過產(chǎn)道和母乳可引起新生兒感染。如累及神經(jīng)系統(tǒng)可造成不同程度的智力障礙以及各種癱瘓、失聰、失明等嚴重后遺癥，影響人口素質(zhì)，因而 TORCH 感染與優(yōu)生優(yōu)育有極為重要的關(guān)系。因此，RCH（IgG和gM）檢查通常也稱為優(yōu)生優(yōu)育十項檢查。目前，TORCH的檢測方法主要有放免（RIA）和酶免(EIA)。由于放免方法需要特殊儀器，且有放射危害，目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特異性強，靈敏度高，簡單快速，成本低等優(yōu)點，只要配備有酶標儀和

12、其他相應(yīng)的設(shè)備 ，多數(shù)普通實驗室均可方便地開展 。 很顯然, 盡快在計生系統(tǒng)普及酶標儀等設(shè)備是一個迫切的需求。 這項工作的落實將有助于提高診治水平，降低母嬰發(fā)病率，從而提高整個國民的健康素質(zhì)。目前市場上提供的EIA試劑越來越多，如：T3、T4、TSH、TORCH 系列、不孕系列、各種癌癥標志物、傷寒、副傷寒等，另外通過母嬰傳播的性傳播疾病(如淋病、梅毒、HIV)和肝炎（如HBV、HCV)，以及胎兒的抗體，新生兒TSH的測定，疫苗反應(yīng)等，市場上也都有成套 EIA 試劑盒供應(yīng)。使用酶標儀有利于拓展檢測項目，提高檢測水平，其社會效益和 經(jīng)濟效益并舉。酶標儀單、雙波長檢測的比較發(fā)布時間04年05月10

13、日 13時59分鄒榮良 在用酶聯(lián)免疫法測定抗原或抗體時，不論是定量試驗還是定性試驗都要求使用酶標儀進行測定。一般的酶標儀在測定中均有單波長和雙波長的模式，并且采用的都是垂直光路。但在日常工作中有時會不太重視單波長和雙波長的選擇，對使用單、雙波長給測定結(jié)果帶來的較大差異也不很了解，并且實際工作中也出現(xiàn)了使用單波長檢測導致抗HCV部分弱陽性的漏檢。因此，本人就酶標儀在選擇單、雙波長使用方面談?wù)剛€人的體會，供同道參考。一 材料和方法 1.材料 由上?？迫A公司提供的乙肝表面抗原測定試劑盒；eppendorf 20-20ul的移液器。 2.儀器 上?？迫A公司的ST-360酶標儀和BIO-RAD 550酶

14、標儀。 3.方法 底物液配制：底物液A、B各5ml混合，加入微量酶標記物，再加入5ml終止液，呈微黃色，混勻待用；利用上?？迫A公司提供的乙肝表面抗原試劑盒的酶標板，用94孔中準確加入150ul配制好的上述底物液，另2孔中加入150ul已終止的空白底物液作空白。在BIO-RAD 550酶標儀上分別進行450nm單波長和450nm及655nm（無630nm）的雙波長檢測，在ST-360上分別進行450nm單波長和450nm及630nm的雙波長檢測吸光度各兩次。二結(jié)果 1.分別對所得結(jié)果進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)單、雙波長測定結(jié)果有較大的差異，雙波長測定結(jié)果的CV值遠小于單波長測定，結(jié)果見表1。 2.對ST-3

15、60兩次重復(fù)測定結(jié)果進行分析，結(jié)果基本一致，見表2。表1 酶標板吸光度在兩臺酶標儀上的測定統(tǒng)計結(jié)果 酶標儀BIO-RAD550ST-360波長450nm450nm+655nm450nm450nm+630nm最小值0.1250.1260.1300.131最大值0.1540.1390.1530.141均值0.13560.13290.13990.1361標準差0.006710.002670.004670.00247CV（%）4.942.013.341.82最大值/最小值1.2321.1031.1771.076表2 ST-360酶標儀兩次吸光度測定統(tǒng)計結(jié)果 波長450mnm450nm+630nm121

16、2最小值0.1300.1290.1310.131最大值0.1530.1520.1410.141均值0.13990.13910.13610.13711標準差0.004670.004950.002470.00229CV（%）3.343.561.821.67三討論 1.酶標儀與分光光度計、自動生化分析儀等的吸光度測定有所不同，一般分光光度計是水平光路，而酶標儀則是垂直光路，但測定原理相同，都是使用朗伯-比耳定律，測定的都是樣本的吸光度。垂直光的特點是標本吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，不足之處是受被測樣本液面是否水平、酶標板透光性、孔底是否平整等的影響較大。 2.酶標儀在用單波長測定吸光度時，除受到

17、測定干擾（樣本的濁度、干擾色等）和電路干擾（包括噪音、漂移、電壓等）等因素外，受液體表面張力的影響也很大。在檢測過程中，由于液體表面張力的作用，液體的表面不是一個平面，而是形成一個凹面，從側(cè)面看似凹透鏡，這樣不可避免會影響光路的正常通過。由于凹液面的影響，光線在通過液體時，除正常被液體吸收一部分外，尚有部分被折射和反射（如光線通過凹透鏡那樣），影響吸光度的檢測。而酶標儀使用的又是通過光導纖維傳播的點光源，如果每次能在同一部位檢測，吸光度的重復(fù)性將得到保證，但由于機械運動等造成的誤差，不可能保證每孔都在相同部位被檢測，因此造成了孔與孔之間有一定的差異。結(jié)果見表1，整塊板單波長檢測的CV在3%以上，吸光度最高值和最低值的相對誤差達17%以上。 3.在雙波長測定中，減少了測定干擾和電路干擾，因此測定結(jié)果明顯好轉(zhuǎn)，結(jié)果見表1，整塊板樣本的CV在2%以下。ST-360在進行穩(wěn)定性觀察中，如表2所示，兩次檢測結(jié)果基本一致，這表明ST-360的穩(wěn)定性較好。同時，從表1也可以看到，科華公司生產(chǎn)的ST-360與BIO-RAD 550的檢測結(jié)果一致，兩者的檢測性能基本相同。 4.由于液體表面張力的不同，導致單波長測定時的誤差較大。并且用不同的洗滌劑會影響到最后加入底物和終止