1、菌落總數(shù)的測定 (GB 4789.22010),一、 目的 1、學習并掌握食品中菌落總數(shù)測定方法和原理。2、了解菌落總數(shù)測定在對被樣品進行衛(wèi)生學評價中的意義 。,二、原理,細菌數(shù)量的表示方法由于所采用的計數(shù)方法不同而有兩種：菌落總數(shù)和細菌總數(shù)。,1、菌落總數(shù) 是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1mL檢樣中形成的細菌菌落總數(shù)。以 CFU/g（mL）來表示。 一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、是否需要氧氣等。,按國家標準方法規(guī)定，即在需氧情況下， 36 1培養(yǎng)482 h，能在平板計數(shù)瓊脂上生長發(fā)育的細菌菌落總數(shù)。所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，

2、由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。,菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，也不能區(qū)分其中細菌的種類，只包括一群在計數(shù)平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的細菌菌落總數(shù)，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。,2 菌落總數(shù)測定的衛(wèi)生學意義 （1）菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。,（2） 食品中細菌菌落總數(shù)越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質量越差；菌落總數(shù)越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗，才能對食品做出較全面的評價。,3、細菌總數(shù) 指一定數(shù)量或面積

3、的食品樣品經(jīng)過適當?shù)奶幚砗?，在顯微鏡下對細菌進行直接計數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細菌總數(shù)也稱細菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1 g或1 mL樣品中的細菌總數(shù)來表示。,三、材料,1、食品檢樣 2、培養(yǎng)基 平板計數(shù)培養(yǎng)基，無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 3、其它 無菌培養(yǎng)皿，無菌吸管，電爐、恒溫培養(yǎng)箱等。,四、流程,1、檢樣 2、做幾個適當倍數(shù)的稀釋液 3、選擇23個適宜稀釋度各1 mL,分別加入滅菌平皿內 4、平皿內傾注1520 mL瓊脂培養(yǎng)基，混勻 5、36 1培養(yǎng)482小時或（242）小時 6、記錄稀釋倍數(shù)和相應的各平板菌落數(shù)量 7、 計算菌落總數(shù) 報告,五、步驟,(一)取樣、稀釋和培養(yǎng)

4、 1、以無菌操作取檢樣25g（mL），放于225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液 的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經(jīng)充分振蕩或研磨制成1:10的均勻稀釋液。 固體和半固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以800010000r/min的速度處理12min，制成1:10的均勻稀釋液。,2、用1 mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的試管內，振搖試管或反復吹打混合均勻，制成1:100的稀釋液。,3、另取1 mL滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1 mL吸管。,4、根據(jù)標準要求或對污

5、染情況的估計，選擇23個適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。 同時分別取1ml稀釋液（不含樣品）加入兩個滅菌平皿內作空白對照。,5、稀釋液移入平皿后，將冷卻至46瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約1520ml，并轉動平皿，混合均勻。,6、待瓊脂凝固后，翻轉平板，置361溫箱內培養(yǎng)482h，水產品301溫箱內培養(yǎng)723h。 如樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4毫升），凝固后培養(yǎng)。,（二）菌落記錄方法 做平板菌落數(shù)記錄時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各

6、平皿的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。 到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于04，但不要超過24h。,1、平皿菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準。每一個稀釋度應采用兩個平皿，大于300的可記為多不可計。,2、其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計算半個平板后乘以2，以代表一個平板的菌落數(shù)。,3、當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每

7、條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。,（三）菌落總數(shù)的計算 1、若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結果。,2、若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內時，應以兩者比值決定。若其比值小于2，應報告兩者的平均數(shù)；若大于等于2，則報告稀釋度較小的菌落數(shù)。,3、若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。,4、若所有稀釋度平板菌落數(shù)均30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)計算。 5、若所有稀釋度平板均無菌落生長，則應按1乘以最低稀釋倍數(shù)計算

8、。,6、若所有稀釋度均不在30300之間，有的300，有的又30，則應以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。,（四）菌落計數(shù)報告方法,1、菌落數(shù)在1100時，按四舍五入報告兩位有效數(shù)字。 2、菌落數(shù) 100時，第三位數(shù)字按四舍五入計算，取前面兩位有效數(shù)字，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可以10的指數(shù)表示。,3、若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。 4、 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。 5、稱重取樣以CFU/g 為單位報告，體積取樣以CFU/mL 為單位報告。,注意事項,1、無菌操作 操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子

9、等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進行。,2、采樣的代表性 如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。,3、稀釋液 樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，或磷酸鹽緩沖液（或0.1蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。,4、每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。 5、傾注用培養(yǎng)基應在46水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無

10、水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。,6、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從1220ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。,7、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。,8、培養(yǎng)溫度一般為37（水產品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30）。培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù)。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不

11、應超過15。,9、為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。,六、結果,1、將實驗測出的樣品數(shù)據(jù)以表格的方式報告。 2、對樣品菌落總數(shù)作出是否符合衛(wèi)生要求的結論。,報告方式,七、思考,1、什么是細菌菌落總數(shù)（cfu）？2、細菌菌落總數(shù)測定的衛(wèi)生學意義是什么？ 3、倒培養(yǎng)基后，為什么要倒置培養(yǎng)？ 4、為什么營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持在461的溫度？,醬油（GB/T2717-2003）： 細菌菌落總數(shù)： 30000 CFU/mL 大腸菌群： 30MPN/100mL 腸道致病菌： 不得檢出,全脂奶粉、脫脂奶粉（GB5410-1999）： 特級 一級 二級 細菌菌落總數(shù)：20000 30000 50000 （CFU/ml） 大腸菌群 40 90 90 （MPN/100g） 腸道致病菌： 不得檢出 不得檢出 不得檢出,巴氏殺菌乳（GB5408.1-1999） 細菌菌落總數(shù)： 30000 CFU/mL 大腸菌群： 90 MPN/100mL 腸道致病菌： 不得檢出,生活飲用水衛(wèi)生標準（GB5749-2006） 菌落總數(shù)cfu/ml： 100 總大腸菌群cfu/100m