1、丹皮酚的含量測定及其分析方法的驗證李超 中藥學(xué) 04摘要：丹皮酚是常用中藥牡丹皮、徐長卿、芍藥等中藥中的主要揮發(fā)性成分之一，是衡量牡丹皮、徐長卿等中藥材及其組方的多種制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。為評價丹皮酚藥材及其復(fù)方制劑的質(zhì)量，人們對丹皮酚的測定方法進(jìn)行了許多研究。該文就丹皮酚的含量測定及分析方法進(jìn)行了評述與探討。關(guān)鍵詞：丹皮酚；含量測定；分析方法丹皮酚(paeonol)為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum(Bunge)Kitagawa.的根或全草中的揮發(fā)性成分之一。為小分子酚類化合物，白色或微黃色

2、有光澤的針狀結(jié)晶，化學(xué)名稱為2-輕基-4-甲氧基苯乙酮（如圖1，分子式為C9H10O3；分子量166.18）。氣味微辣，極性較低，熔點49-51，易溶于乙醇和甲醇，溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿及二硫化碳中，稍溶于水，不溶于冷水，在熱水中可溶解，能隨水蒸氣揮發(fā)1。丹皮酚味苦、辛，丹皮酚具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、抗血栓形成、擴張管、降血壓、降血糖等，還具有抗炎、抗菌抗病毒及調(diào)節(jié)免疫功能等作用2。丹皮酚是衡量牡丹皮、徐長卿等中藥材及以其組方的多種制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。2015版藥典規(guī)定牡丹皮按干燥品計算，含丹皮酚不得少于1.2%，徐長卿按干燥品計算，含丹皮酚不得少于1.3%3。為評價含丹皮酚藥材

3、及其復(fù)方制劑的質(zhì)量，人們對丹皮酚的測定方法進(jìn)行了許多研究。本文就丹皮酚的含量測定的分析方法作一概述。1薄層掃描法薄層掃描法準(zhǔn)確、靈敏，重現(xiàn)性好，專屬性強，可作為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。章睿4等以丹皮酚為對照品，建立了牡丹皮藥材及其飲片的薄層掃描特征圖譜，該方法簡便、設(shè)備價廉、分析速度快等，易于使用，尤其適合對大批原料藥材進(jìn)行分析。宋飛5用硅膠G薄層板以雙波長薄層掃描測定六味地黃丸中丹皮酚含量，展開劑為環(huán)乙烷:氯仿:無水乙醇(7：3：1),顯色劑為5%酸性FeCl3,掃描條件為s=400nm,R=700nm,反射法鋸齒掃描精密度試驗結(jié)果平均值為16926.6,RSD=2.8%(n=6)；穩(wěn)定性實驗結(jié)果表

4、明在1h內(nèi)穩(wěn)定?；厥章蕿?3.12%,RSD為3.44%(n=5)。苗方6等用此法測定了觀賞牡丹中，丹皮酚的含量為1.5mg/g,加樣回收率為97.6%,RSD為1.15%?？瞻赘蓴_試驗表明本測定無明顯干擾;相關(guān)系數(shù)R=0.9987表明在其范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系;對照品和供試品斑點在測定時間100min內(nèi)斑點穩(wěn)定,峰面積積分值基本不變;精密度試驗結(jié)果平均值為1.165mg/g,RSD=1.76%(n=6),表明重復(fù)性良好;加樣回收率試驗結(jié)果測定的平均回收率為97.60%,RSD為1.15%(n=5)。2激發(fā)熒光掃描法掃描法多在(2741)nm處進(jìn)行掃描測定，供試品溶液的濃度相對較高(0.5mg

5、/mL)，線性范圍在15g，對丹皮酚含量低微的樣品，掃描法根本無法檢出。遇到高效液相法丹皮酚波峰有干擾的情況下，定量測定就更難以進(jìn)行。為開發(fā)丹皮酚不同形式的、高靈敏度測定方法，對丹皮酚進(jìn)行增熒光后，熒光薄層掃描定量測定研究，獲得理想的測定結(jié)果，大幅度提高了丹皮酚的檢測靈敏度以及方法的重現(xiàn)性和精密度。李曉燕等7以激發(fā)熒光掃描法測定微量丹皮酚。用硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(8:2:1:0.2)為展開劑，三氯化鋁試液為增熒光劑，進(jìn)行了微量丹皮酚的熒光掃描定量測定研究。結(jié)果顯示丹皮酚最佳激發(fā)波長為292 nm，點樣量在0.04020.1809g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999

6、7)，同板精密度試驗中RSD為1.59%，樣品的RSD為0.81%；異板精密度試驗中樣品的平均含量為25.68 mg/g，RSD為1.31%；儀器精密度試驗中照品的RSD為0.59%，樣品的RSD為0.09%，表明儀器性能良好。穩(wěn)定性試驗在考察的1.5 h內(nèi)，對照品的RSD為2.39%，樣品的RSD為2.68%。重復(fù)性試驗中樣品丹皮酚的平均含量為25.62 mg/g，RSD%為1.83%，表明方法重復(fù)性良好。平均回收率為101.80%,RSD為1.58%(n=9)。此法簡便、準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于微量丹皮酚樣品的測定。3氣相色譜法氣相色譜法是一種在有機化學(xué)中對易于揮發(fā)而不發(fā)生分解的化合物進(jìn)行分

7、離與分析的色譜技術(shù)，所以非常適合對牡丹皮中丹皮酚進(jìn)行詳細(xì)的分析8。劉向紅9以氣相色譜法測定丹皮酚原料及片劑的含量。采用GC內(nèi)標(biāo)法,色譜柱為3.2 mm210mm玻璃柱,固定相為聚乙二醇(PEG)-20000,;精密度試驗結(jié)果表明方法精密度良好,RSD為0.64%(n=6)。平均回收率為99.9%，RSD=1.5%(n=9)；重復(fù)性試驗結(jié)果表明方法重復(fù)性好，原料和片劑的RSD分別為0.81%(n=6)和1.34%(n=6)；溶液穩(wěn)定性試驗表明原料、片劑供試溶液在48 h內(nèi)均穩(wěn)定，原料和片劑的RSD分別為0.96%和1.24%(n=7)。本方法簡便、準(zhǔn)確、快速,可作為丹皮酚原料及片劑含量的測定方法

8、。石向群等10以氣相色譜法測定桂枝茯苓膠囊中丹皮酚的含量。色譜柱為DB-624(0.53mmx30mx3N,m)，按外標(biāo)法測定丹皮酚的含量，結(jié)果表明丹皮酚在20200g/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（R=0.9996），方法精密度試驗SD%為1.00。計算樣品丹皮酚平均含量為7.80 mg/g，RSD為1.29%。平均加標(biāo)回收率為108.70%,RSD%為1.38(n=3)。4高效液相色譜法劉雯等11建立了測定原料中月皮酚含量的高效液相色譜方法。采用Agilent ODS C18(250 mm4.6 mm,5m)色譜柱，以純水-甲醇(體積比為27:73)為流動相，流速為1.0 mL/mi

9、n，柱溫35,檢測波長274 nm。當(dāng)流動相體積比為2773時，丹皮酚的保留時間約為4.927 min周圍沒有干擾且峰形良好。R=0.9999表明丹皮酚在0.02020 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，即峰而積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。根據(jù)信噪比S/N=3，測得丹皮酚的檢出限為0.6 mg/L。精密度實驗RSD為0.40%(n=6)，所測樣品的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，儀器精密度良好。結(jié)果表明，重復(fù)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%，回收率在95%105%范圍內(nèi)。該方法的靈敏度高，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好，有效消除了樣品中其他組分對目標(biāo)峰的干擾，線性范圍寬，分離度好，可用來準(zhǔn)確分析原料中月皮酚的含量。冷英

10、梅等12建立采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定不同產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚的含量方法采用Hypersil ODS2 C18色譜柱，以甲醇-水(45:55)為流動相，檢測波長為274nm結(jié)果丹皮酚在0.00469.200g/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度實驗表明精密度良好，RSD為1.46%(n=6)；穩(wěn)定性實驗表明供試品溶液中丹皮酚在12h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.96%(n=6)；重復(fù)性實驗表明此方法測定丹皮酚的含量，重現(xiàn)性良好，RSD為1.25%(n=6)。平均回收率為99.3%,RSD為2.16%(n=6)。本法簡便、快捷、重復(fù)性好，可用于不同產(chǎn)地牡丹皮藥材中丹皮酚的含量測定回收率

11、符合相關(guān)規(guī)定。蘭保強等13采用HPLC法測定丹皮酚緩釋片中丹皮酚的含量。方法色譜柱為Shim-pack VP-ODS柱(150 mm4.6mm,5m），流動相為甲醇-水(70:30)，流速1.0 mL/min，檢測波長274 nm。結(jié)果丹皮酚0.0840.840g與峰面積的線性關(guān)系良好R=0.9999；精密度表明方法的精密度良好，RSD=0.24%(n=6)；重復(fù)性試驗計算得丹皮酚含量的平均值為404.81mg/g，RSD=1.38%(n=6)。計算得丹皮酚峰面積的RSD=0.31%(n=8)，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；平均回收率為99.20%,SD=1.60%（n=6）。結(jié)論所用方法操作簡

12、單、結(jié)果可靠、重復(fù)性好，可較好地控制丹皮酚緩釋片的質(zhì)量。宋欽蘭等14采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18柱，流動相為甲醇-水(43:57,V/V)，流速為1.0 ml/min，檢測波長為274 nm，柱溫為25，進(jìn)樣量為10L。丹皮酚進(jìn)樣量在0.09304-0.4652g，R=0.9999)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好;精密度RSD=0.38%(n=6)表明儀器精密度良好;重復(fù)性實驗中丹皮酚含量平均值為0.150 mg/g,RSD=1.56%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗中丹皮酚峰面積RSD=1.08%(n=6)，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定;平均加樣回收率為98.

13、33%,RSD=0.81%(n=6)。該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于糖腎康顆粒中丹皮酚的含量測定。5高效液相色譜紫外分光光度聯(lián)用法閆一夫15等將色譜光譜儀聯(lián)用(HPLCUV)法與斜投影法結(jié)合，建立了丹皮酚含量快速分析方法。通過色譜-光譜聯(lián)用采集丹皮酚結(jié)晶母液的紫外多波長光譜三維數(shù)據(jù)，構(gòu)建不含丹皮酚的背景數(shù)據(jù)庫以及丹皮酚光譜數(shù)據(jù)庫，基于斜投影法步驟測定了批量樣本中丹皮酚含量。該方法計算結(jié)果和高效液相色譜分析結(jié)果接近，相對誤差小于5.0%。測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%1.0%(n=5)，回收率為98.8%101.3%。該方法快速、準(zhǔn)確，操作簡單，可為丹皮酚結(jié)晶產(chǎn)品及各種制劑質(zhì)量控制提供可行方案

14、。相對誤差小于5.0%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%1.0%，說明該方法具有良好的精密度。6 紫外分光光度法高錦紅16采用紫外分光光度法對牡丹皮中丹皮酚進(jìn)行測定。取對照品溶液，以無水乙醇作空白對照，在200500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見光掃描。丹皮酚在274nm處有最大吸收峰。線性關(guān)系考察R09999；精密度試驗結(jié)果，吸光度平均值為0.662，RSD為0.19（n=6）；樣品含量測定,平均檢出量6.142g/mL,丹皮酚含量38.39mg/g。重現(xiàn)性結(jié)果RSD為0.32（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性結(jié)果的RSD為0.18%（n=6），樣品在lOh內(nèi)保持穩(wěn)定

15、；回收率的平均值為101.4，RSD為0.75（n=6），表明該方法的回收率較好，達(dá)到了測定要求，可用于牡丹皮中丹皮酚含量的檢測。楊名宇等17為考察牡丹皮藥材和飲片的有效期，以丹皮酚為檢側(cè)指標(biāo)，采用紫外分光光度法，以274 nm為側(cè)定波長。結(jié)果丹皮酚在2.4-12.0g/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，得回歸方程，R=0.9999；重復(fù)性RSD為0.12%(n=5)與穩(wěn)定性實驗RSD=0.32%(n=5),A基本無變化。平均回收率為99.94%,RSD為0.12%(n=5)。我們還可以通過紫外分光光度法對不同生長年限、不同采收期丹皮中丹皮酚含量，揭示丹皮中丹皮酚的積累規(guī)律，提示丹皮的最佳采收期

16、18-19。7 近紅外光譜丹皮酚含量的近紅外定量分析模型建成之后，可簡便、快速、無污染地測定丹皮酚的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該技術(shù)適用于杞菊地黃丸生產(chǎn)、流通等對檢測結(jié)果要求時效性較強的各個環(huán)節(jié)，為其質(zhì)量評價提供一種新的檢測方法。白雁等20利用近紅外光譜技術(shù)為杞菊地黃丸(濃縮丸)中丹皮酚含量，以杞菊地黃丸中丹皮酚含量的HPLC分析作為參照，結(jié)合最小二乘法(PLS)建立丹皮酚含量的定量分析模型。結(jié)果所建模型的相關(guān)系數(shù)(R)、外部驗證均方差(RMSEP)和內(nèi)部交叉驗證均方差(RMSELV)分別為0.98089,0.06170和0.19403;驗證集樣品的NIR測定與藥典法側(cè)定的進(jìn)行配對T檢驗，差異無統(tǒng)計

17、學(xué)意義。所以近紅外光譜法可用于杞菊地黃丸中丹皮酚含量的快速側(cè)定。AOTF-NIR技術(shù)用于濃縮六味地黃丸濃縮液比重及丹皮酚含量分析，具有快速、直接、多成分同時測定，并能實現(xiàn)現(xiàn)場在線分析的特點。胡浩武等21在線收集濃縮六味地黃丸濃縮液樣品，建立其含量、比重數(shù)據(jù)庫，同時采集近紅外光譜圖譜，用偏最小二乘(PLSl)法分別建立NIR光譜與含量、密度數(shù)據(jù)之間的校正模型，并對在線過程中收集的預(yù)測集樣品進(jìn)行含量預(yù)測來驗證所建模型。結(jié)果濃縮液NIR光譜與含量、比重數(shù)據(jù)之間的校正模型相關(guān)系系數(shù)R分別為0.9945,0.9967和0.9522,外部樣品預(yù)測相對偏差分別為0.26%,5.39%和10.44%;該方法精

18、密度、穩(wěn)定性均小于2.0%，預(yù)測回收率分別為99.9%,100.2%,92.8%。8 熒光增敏法梁慧婷等22建立測定咽炎片中丹皮酚含量的熒光分析法。方法基于AlCl3試劑對于丹皮酚具有熒光增敏作用，在pH7.0的磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖體系中，于最大發(fā)射波長em=455 nm處(最大激發(fā)波長=295nm)下檢測丹皮酚的含量。結(jié)果丹皮酚的濃度在1.310-47.3110-4g/ml內(nèi)與熒光強度增大值F呈線性關(guān)系良好(R=0.999)，檢出限為0.8110-4g/ml，室溫下熒光強度在10 h內(nèi)基本恒定。回收率為95.4%97.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.53%。熒光增敏確可靠，可應(yīng)用于咽炎片中丹

19、皮酚含量的測定。9 電化學(xué)方法鄭艷潔等23應(yīng)用交流阻抗法和循環(huán)伏安法表征聚蘇丹紅/GC電極，并研究丹皮酚在該聚合物電極上的電化學(xué)行為.實驗表明，聚蘇丹紅/GC電極對丹皮酚具有良好的電催化作用，丹皮酚氧化峰電流(Ipa，A)與濃度(C,mol/L)在0.3-22.0mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系R=0.9994，檢測限為5.010-8 mol/L，與在GC電極的響應(yīng)相比，其靈敏度提高了1個數(shù)量級。電極穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好，干擾實驗表明上述共存物均不干擾測量.由此可見聚蘇丹/GC電極抗干擾能力強，對丹皮酚的測定有較好的選擇性。馮蕓等24運用循環(huán)伏安法(CV)、計時電流法(CA)、方波伏安法(SWV

20、)及電化學(xué)交流阻抗(EIS)等電化學(xué)方法，研究丹皮酚在十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)現(xiàn)場自組裝膜與離子液體N-丁基毗陡六氟磷酸鹽復(fù)合修飾碳糊電極上的電化學(xué)性質(zhì)及電分析方法，測定了丹皮酚在該電極上的電極反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。用SWV法測得PN的氧化峰電流與其濃度在5.010-5-3.810-4 mol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢測限(S/N=3)為2.010-6mol/L，電極重現(xiàn)性實驗中RSD為2.900%(n=10)，穩(wěn)定性實驗中其RSD為3.000%(n=10)，表明本法具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。對模擬樣品中丹皮酚含量進(jìn)行了電化學(xué)定量測定，RSD為0.2%-2.1%(n=10)，加標(biāo)回收率為99.

21、2%101.3%。表明十二烷基苯磺酸鈉現(xiàn)場自組裝膜與離子液體復(fù)合修飾碳糊電極對丹皮酚電化學(xué)氧化具有良好的促進(jìn)作用，該研究結(jié)果可用于丹皮酚片樣品中丹皮酚含量的定量測定。張葉等24利用丹皮酚在超微電極上的電化學(xué)行為，建立六味地黃丸中丹皮酚含量監(jiān)控方法。使用超微電極、快速方波伏安掃描（SWV)技術(shù)進(jìn)行電化學(xué)檢測。結(jié)果可獲得丹皮酚的重現(xiàn)性良好的氧化峰，該峰電流與丹皮酚的濃度在110-3510-7mol/L范圍內(nèi)成呈良好的線性關(guān)系，R=0.9993，檢出限為110-7mol/L。重現(xiàn)性實驗RSD為0.31%（n=5）重現(xiàn)性很好。穩(wěn)定性實驗在12 h內(nèi)測得的峰電流及峰位置無明顯差異，穩(wěn)定性很好加樣回收率實

22、驗，平均回收率100.7%，RSD=2.2%（n=5）。樣品含量檢測獲得的樣品含量為0.321%，RSD為1.28%（n=5）。10 討論目前除了以上方法外，文獻(xiàn)中還?？吹降臏y量方法很多。由于這些方法都有各自的優(yōu)缺點，因此使用時應(yīng)根據(jù)情況使用。考慮到大部復(fù)方制劑中藥味較多，有效成分以及構(gòu)成復(fù)雜，多數(shù)情況下還是選擇高效液相或者氣象色譜做定量分析比較理想，同時操作簡單、迅速，結(jié)果也較為理想。采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段對以前的測定方案改革，不斷提高測定含量的技術(shù)的思路是正確的。如何才能真正控制中成藥的質(zhì)量是一個復(fù)雜的問題，有待我們進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1李玉賢,左靜靜.丹皮酚的提取工藝及熒光性質(zhì)J.光譜實

23、驗室,2011,28:2626-302郭齊,李貽奎,王志國,等.丹皮酚藥理研究進(jìn)展J.中醫(yī)藥信息,2009,26(1):20-24.3國家藥典委員會.中國藥典S,2015.4章睿,王成永.薄層掃描特征圖譜在牡丹皮飲片質(zhì)量控制中的應(yīng)用J.中醫(yī)藥臨床雜志,2013,25(6):539-541.5宋飛.六味地黃丸中丹皮酚含量測定實驗研究J.中國醫(yī)藥指南,2013,11(4):95-97.6苗方,李琳,趙訓(xùn)允,等.薄層色譜法測定山東觀賞牡丹中丹皮酚的含量J.華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,12(4):485-486.7李曉燕,許紅輝,韓桂茹,等.激發(fā)熒光掃描法測定微量丹皮酚的研究J.中成藥,2011,33(1):179-182.8孔平.牡丹皮的化學(xué)成分分析研究概況J.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,6(2):13.9劉向紅.氣相色譜法測定丹皮酚原料及片劑的含量J.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010,27(5):760-762.10石向群.氣相色譜法測定桂枝茯苓膠囊中丹皮酚的含量J.廣州化工,2015,43(4):145-173.11劉雯,劉佳樂,黃亮,等.HPLC法測定原料中丹皮酚含量的研究J.廣州化工,2015,42(9):219.12冷英梅,董向光.RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地牡丹皮中丹皮酚的含量J.中國藥物經(jīng)濟學(xué),2014,10(1):211-212.13蘭保強,饒偉源張