1、siRNA與癌癥治療的探究,siRNA的簡(jiǎn)介,小干擾RNA（Small interfering RNA；siRNA）有時(shí)稱為短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是長(zhǎng)度20到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。此外，也參與一些與RNAi（RNA interference 核糖核酸干擾）相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、阻斷細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)生的有害活動(dòng)，如腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是要成功地將siRNA傳送到特異性的細(xì)胞中

2、而不對(duì)其它細(xì)胞產(chǎn)生不利影響還一直是個(gè)難題。 本次,siRNA通常是一段長(zhǎng)21個(gè)核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個(gè)核苷酸，圖示如下： 每一股各有一個(gè)5磷酸基末端與一個(gè)3羥基末端。此結(jié)構(gòu)經(jīng)dicer作用而得，dicer是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)。 此外，siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效

3、果。本質(zhì)上，任何已知序列的基因都可以、也因此是經(jīng)過(guò)適當(dāng)剪裁而具有序列互補(bǔ)性的siRNA的作用對(duì)象。這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項(xiàng)重要工具。,RNA沉默是存在于生物中的一種古老現(xiàn)象, 是生物抵抗異常DNA(病毒、轉(zhuǎn)座因子和某些高 重復(fù)的基因組序列)的保護(hù)機(jī)制, 同時(shí)在生物發(fā) 育過(guò)程中扮演著基因表達(dá)調(diào)控的角色，它可以通 過(guò)降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮 作用，因此在治療癌癥腫瘤中有很大的應(yīng)用前景。,siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA激活的RISC 通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)

4、制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。 另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi) 同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默。,歸納siRNA的特點(diǎn),siRNA在RNAi應(yīng)用中的缺陷,在RNAi實(shí)驗(yàn)中，化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法都是在體外得到siRNA后再導(dǎo)入 細(xì)胞內(nèi)，但是這兩種方法主要有兩方面無(wú)法克服的缺點(diǎn)：siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容 易被降解；進(jìn)入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間短。針對(duì)這種情況， 出現(xiàn)了質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA體內(nèi)表達(dá)。 該方法的

5、基本思路是： 將siRNA對(duì)應(yīng)的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動(dòng)子后， 這樣就能在體內(nèi)表達(dá)所需的siRNA分子。這種方法總體的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直 接操作RNA，能達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默效果。,質(zhì)粒表達(dá)siRNA的優(yōu)點(diǎn),通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)siRNAs大都是用Pol III啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA (small hairpin RNA)的序列。選用Pol III啟動(dòng)子的原因在于 這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA， 遇到45個(gè)連續(xù)的U即終止，非常精確。當(dāng)這種帶有Pol III 啟動(dòng)子 和shRNA模板序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá)siRNA 的質(zhì)粒

6、確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，可抑制外源基因和內(nèi)源基因。 采用質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載 體能夠更長(zhǎng)時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。當(dāng)然還有一點(diǎn)，那就是由于質(zhì)粒 可以復(fù)制擴(kuò)增，相比起其它合成方法來(lái)說(shuō)，這就能夠顯著降低制備siRNA 的成本。,此外，帶有抗生素標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體可用于長(zhǎng)期抑制研究， 通過(guò)抗性輔助篩選，該質(zhì)?？梢栽诩?xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表 達(dá)數(shù)星期甚至更久（比如Clontech（現(xiàn)屬于Takara）的RNAi -Ready表達(dá)載體）。另外帶有熒光標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體也 受到研究者的重視與歡迎，因?yàn)閹晒鈽?biāo)記的表達(dá)載體，可以 讓研究人員通過(guò)熒光標(biāo)記

7、很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的 基因的沉默效率。可通過(guò)熒光顯微鏡觀察含有shRNA的細(xì)胞 或通過(guò)流式細(xì)胞儀富集被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。同時(shí)熒光蛋白的表達(dá)與 shRNA的表達(dá)是獨(dú)立的，因此不影響shRNA基因沉默的效果。,帶有標(biāo)記的siRNA表達(dá)載體,研究人員將編碼人類端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）， 長(zhǎng)67bp的寡核苷酸引入pSIREN一種重組腺病毒構(gòu)建中的穿梭載體。 然后將U6-RNA啟動(dòng)子和siRNA編碼insert從pSIREN上剪切下來(lái)，亞克隆進(jìn) pAdeno-X，構(gòu)建出了質(zhì)粒pAd-hTR。 接著研究人員將pAd-hTR轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK-293，獲

8、得了攜帶 有hTR靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，研 究人員證明了Ad-hTR-siRNA介導(dǎo)的端粒酶沉默在HeLa細(xì)胞中的作用。同時(shí) 將Ad-hTR-siRNA與Ad-NT-siRNA進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)前者能極大的降低HeLa細(xì) 胞中hTRmRNA水平（by 70.21%），和端粒酶活性（by 58.87%）。而且 會(huì)引起HeLa細(xì)胞凋亡。 利用Ad-hTR-siRNA進(jìn)行皮下腫瘤異種移植治療可以減緩腫瘤的生長(zhǎng)，其 中至少部分是由于體內(nèi)細(xì)胞凋亡（P0.05）?？偠灾?，這些研究結(jié)果證明 了hTR siRNA在HeLa細(xì)胞系中有效和特異的端粒酶的敲除，從而指

9、出了這種 siRNA表達(dá)重組腺病毒系統(tǒng)在癌癥基因治療方面的前景。,siRNA病毒載體減緩腫瘤生長(zhǎng),德克薩斯州學(xué)M. D. Anderson癌癥中心的項(xiàng)新研究顯示，裝載在一微小的脂肪球中的一種分子開(kāi)關(guān)（siRNA）能夠滲入卵巢癌腫瘤細(xì)胞中“掐死”一種討厭的蛋白并明顯縮小腫瘤的尺寸。該項(xiàng)研究的結(jié)果刊登在8月15日的Clinical Cancer Research雜志上，這項(xiàng)研究還成為該期雜志的封面故事。 小鼠模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)一種強(qiáng)有力的短干擾RNA（siRNA）傳遞系統(tǒng)能夠攻擊癌癥。SiRNA是一種能用于沉默基因關(guān)閉有害蛋白制造的偉大技術(shù)。在離體實(shí)驗(yàn)中，這種技術(shù)的效果很好，但是難點(diǎn)是如何能夠讓它進(jìn)入到

10、腫瘤中。因?yàn)槎痰腞NA片段在沒(méi)有被直接注射的情況下無(wú)法進(jìn)入到腫瘤中，并且實(shí)驗(yàn)室用的注射方法在臨床中是不能適用的。,10/5/2020,這研究組將能靶向一種促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞存活和擴(kuò)散的蛋白質(zhì)的siRNA轉(zhuǎn)載進(jìn)一種脂質(zhì)體（一種脂肪球，體積非常?。┲?。研究人員對(duì)感染了三種人類卵巢癌細(xì)胞系的小鼠進(jìn)行了3到5周的處理。這些小鼠接受了含有FAK siRNA、對(duì)照siRNA或空處理。一些小鼠接受了siRNA脂質(zhì)體和化療藥物docetaxel。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接受了FAK沉默脂質(zhì)體的小鼠的腫瘤重量與對(duì)照組相比，減少了4472；聯(lián)合使用了FAK沉默脂質(zhì)體和藥物docetaxel的小鼠，其腫瘤腫瘤減少了9498。而

11、且這種聯(lián)合方法對(duì)docetaxel抗性卵巢癌細(xì)胞系同樣有用。,10/5/2020,10/5/2020,武漢大學(xué)中南醫(yī)院胃腸科教授鄧長(zhǎng)生在International Immunopharmacology上發(fā)表RNAi文章，解析以siRNA治療胃癌的新成果。 胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在癌癥致死原因中列第二。武大中南醫(yī)院鄧長(zhǎng)生教授、夏冰教授等在先前的研究中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)易感基因，與湖北漢族人胃癌顯著相關(guān)，尤其是在湖北漢族人群腫瘤壞死因子基因位點(diǎn)上，檢測(cè)出一新的等位基因，為胃癌的早期診斷和治療提供了一項(xiàng)新方法。找到靶位基因后，鄧長(zhǎng)生教授等嘗試用最新的RNAi技術(shù)治療胃癌。鄧教授研究小組以surv

12、ivin為靶位設(shè)計(jì)siRNA，構(gòu)建了一個(gè)Psilencer 2.1-surivin siRNA質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入胃癌MGC-803細(xì)胞系中，同時(shí)還將該細(xì)胞系注入裸鼠體內(nèi)，觀察該siRNA的效果。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠細(xì)胞內(nèi)的surivin基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量顯著下降，并且surivin蛋白表達(dá)量也下降，癌細(xì)胞凋亡率升高?？偟膩?lái)說(shuō)，該siRNA靶位可有效的抑制胃癌細(xì)胞增殖，可能成為胃癌的潛在治療靶位。,siRNA在胃癌癥治療的發(fā)現(xiàn),10/5/2020,Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Surv

13、ivin是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，Survivin功能復(fù)雜，具有抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且參與細(xì)胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生等作用。目前，Survivin已成為研究的熱點(diǎn)。 Survivin在人類各種腫瘤組織癌細(xì)胞中含量很豐富，但在正常細(xì)胞中卻幾乎不存在。體內(nèi)外研究表明，Survivin可在多 種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中表達(dá)，并見(jiàn)于所有人類最常見(jiàn)的腫瘤組織，包括肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。,Survivin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),靶向surviv in的siRNA對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的影響設(shè)計(jì)并合成3條靶向surviv in的小分子干擾RNA( siRNA), 構(gòu)建表達(dá)性

14、干擾RNA質(zhì)粒( shRNA ) shRNAsurvivin-1、shRNA-surv iv in-2和shRNA-surv iv in-3, 分別轉(zhuǎn)染胃癌BGC-823 細(xì)胞, 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾RNA 沉默surv ivin mRNA 表達(dá)效果, W estern b lo t觀察對(duì)胃癌BGC-823 細(xì)胞surv iv in蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制, MTT( 四甲基偶氮唑鹽)比色法分析檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率, 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡率, 探討干擾RNA 對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。,10/5/2020,結(jié)果 在體外, shRNA-surv iv in-1有效沉默人胃癌BGC-823細(xì)胞surv iv in mRNA 的表達(dá), 使surviv in mRNA 相對(duì)水平明顯降低( P 0. 05), su rv iv in蛋白質(zhì)表達(dá)抑制, 72 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)74. 92% ( P 0. 05),shRNA-surv iv in-1使G2 /M 期細(xì)胞百分比明顯增加, 凋亡率顯著增加(P 0. 05)。結(jié)論 shRNA-surv iv in-1可以沉默surv ivin基因的表達(dá), 可以顯著抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖, 在一