1、液相色譜柱的分類和維護(hù)一、色譜柱基本知識色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3，5，7，10um等，柱效理論值可達(dá)516萬米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難的分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般1030cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，也要有合

2、理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍料徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。1.柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70Kg/cm2 時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的

3、光潔度，其效果與拋光相同還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2-20um(5-10 um),取決于填料粒度,目的是防止填料漏出，柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。2.柱的發(fā)展方向因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長310cm，填料粒徑23um。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（MICROBORE）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省流動相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長柱達(dá)到高分離度；容易控制柱溫；易于實(shí)現(xiàn)LCMS聯(lián)用。但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的

4、影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1100ul/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因進(jìn)樣量小，要求高靈敏度檢測器，電化學(xué)檢測幫質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。3.柱的填充色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度20um 時，干法填充制備柱較為合適；顆粒20um時，濕法填充較為理想。填充方法一般有四種：高壓勻漿法，多有用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters 專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法，柱填充的技術(shù)性強(qiáng)，大

5、多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用己填充好的商品柱。必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是否合理。二、液相色譜柱規(guī)格色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm,柱長1030cm；窄徑柱（narrow bore），內(nèi)徑12mm，柱長1020cm；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.20.5mm；半制備柱，內(nèi)徑5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。 色譜柱了解1）平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小)柱壓越高(滲透性

6、差)顆粒分布 顆粒分布越寬柱效低(滲透性差)顆粒形狀球型柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻 無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻 流動相線性速度不均勻，譜帶擴(kuò)展2）鍵合相化學(xué)1.影響化合物的分離度： 2.不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同a 3.可能導(dǎo)致色譜的分離機(jī)理不同3.如：C18、C8、CN3）含碳量1.含碳量越高，k值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）2.高含碳量 有利于不易保留的化合物的分離 水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好 有利于極性化合物的拖尾改善3.低含碳量 有利于分析中性及堿性化合物 降低溶劑損耗 填料的端基封口 封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%） 不同色譜柱的含碳量如下所示

7、：4）填料的端基封口 封口殘余硅羥基 減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% - 1%）5）硅膠的活性 主要影響堿性化合物的保留行為：k，生產(chǎn)硅膠時處理溫度不同，硅膠活性也不同，是選擇性差異的主要來源，硅膠的雜質(zhì)含量，重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小，是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志，填料的穩(wěn)定性，硅膠填料，pH：2-8，聚合物填料，pH：2-12，pH值小于2時，鍵合相水解，液相色譜法能否將某一樣品完全分離，主要取決于色譜柱的選擇性和柱效，這在很大程度上取決于固定相的選擇是否適當(dāng)。6）色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑 檢測的靈敏度、樣品的容量 長度 分離度，理論塔板數(shù) 速度 樣品的容量 檢測的靈敏度7）柱

8、性能評價：購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在5%或10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評價報告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。 三.色譜柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降低柱效，縮短使用壽命甚至損壞.在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護(hù)色譜柱避免

9、壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時的轉(zhuǎn)動不能過緩（如前所述）應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去柱內(nèi)的雜質(zhì)否則反沖會迅速降低柱效選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞有時可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直

10、接注入柱骨需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱保護(hù)柱一般是填有固定相的短柱保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)，在進(jìn)行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75。下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：正相硅膠柱以正已烷（或庚烷）二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流

11、動相不含緩沖液，那么可以省略最后一步用水沖洗。一氯甲烷能洗支殘留的非極性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混全溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1）梯度洗能除去蛋白質(zhì)污染。陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水、甲醇、水依次沖洗。保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱

12、頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。通常色譜柱壽命在正確使用時可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH29范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降。 每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔45天開機(jī)沖洗15分鐘。9.柱的保養(yǎng)：當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑

13、作為流動相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；四、正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法 反相色譜法固定相極性 高中 中低流動相極性 低中 中高組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。5、 1.色譜柱的使用說明1）、色譜柱使用前注意事項(xiàng)：色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，一定要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高

14、濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應(yīng)先用10左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出，堵塞色譜柱。2） 、流動相：流動相中所使用的各種有機(jī)溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水最好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經(jīng)過0.45m的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是2.0-8.0，BDS C18適合于堿性化合物，pH值適用范圍為2.0-10.0。當(dāng)必須要在pH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱

15、儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并完全置換掉原來所使用的流動相。3）、樣品：樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱（SPE）對樣品進(jìn)行預(yù)處理；若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。2、 色譜柱的保存1） 、反相色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。2）、長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)

16、格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。3、 色譜柱的再生因?yàn)樯V柱是消耗品，隨著使用時間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降。1） 、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。2） 正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。4、 色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法色譜柱在使用中最常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點(diǎn)：1） 、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；2） 色譜柱頭的填料被樣品污染；3） 色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有