1、基因的克隆、表達載體構(gòu)建及功能驗證（一般性方法）一、 基因克隆 事前三問a.克隆這個基因干什么？它有什么功能？b.這個基因在哪種材料中擴增？c.材料需要怎么處理？ 實驗前準備工作 a.設計引物，準備材料，b.購置試劑：Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、連接試劑盒c.實驗試劑及用具：槍頭、離心管、培養(yǎng)皿、濾紙滅菌；Amp+ 、Kan+等抗生素準備 基本流程 提取和純化RNAcDNA第一條鏈合成PCR凝膠電泳膠回收連接轉(zhuǎn)化涂平板挑單菌落搖菌提質(zhì)粒測序1.總RNA的提取、純化及cDNA第一鏈合成1.1葉片、根總RNA的提取 Trizol是一種高效的總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸

2、胍等物質(zhì)，能迅速裂解植物細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且純度高，以利于下一步的實驗。 1） 實驗前準備預先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 過夜處理12 h），高溫滅菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研缽、量筒、試劑瓶等需200滅菌至少4 h，所用槍頭和槍盒均去RNA酶處理(直接購買)。2) Trizol 法（小麥）葉片或根的總RNA實驗步驟如下：（1）提前在1.5 ml離心管中加入1 mlTrizol，然后將200 mg樣品液氮中研磨成白色粉末，移入管內(nèi)，用力搖15 s，在15-30溫育5 min，使核酸蛋白復合物完全分離。（2）

3、4，12000g離心10min，取上清，離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。（3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，蓋好蓋，用力搖15 s，1530 溫育23 min。（4）在12000g，4離心10 min，樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層，RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。（5）將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中，加2倍體積的無水乙醇沉淀RNA，室溫靜止30 min。（6）在12000g，4離心10 min，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。（7）用1 ml的75%乙醇洗RNA，

4、渦旋振蕩樣品，在7500g，4離心5 min，棄上清。（8） 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘，加無RNase的水100l用槍頭吸幾次，5560溫育10 min使RNA溶解。（9）配制以下體系：10DNase buffer 5 lDNase I （RNase-free）（40 g/l） 1 lRNasin Inhibitor（40 g/l） 1 lTotal RNA 70 g加去RNase水至總體積為50 l（10）37 水浴1h，加DEPC處理的水至總體積為100 l，加入等體積氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 l的3 mol/L NaAC溶液，200 l的無水乙醇

5、，-80 沉淀30 min。（12）28 ，12000g離心10 min，棄清液，干燥后取50l無RNase的水溶解RNA。3） RNA的質(zhì)量及純度檢測 （1）電泳檢測 取2ul RNA 與1 ul 10Loading buffer上樣緩沖液混合均勻在1% 的瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察RNA 條帶并記錄實驗結(jié)果。（2）分光光度計RNA純度檢測 取1ul RNA液，以DEPC水為空白對照，測定A260/ A280 比值，估測RNA質(zhì)量。4） cDNA第一條鏈的合成 按照以下體系將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA：1） 在Eppendorf管中配制下列混合液：試劑名稱 使用量模板RNA

6、1 gOligo dT primer (50 M) 1 ldNTP Mixture(10 mM) 1 lRNase free dH2O up to 10 l2） 65 保溫15 min 后迅速在冰上急冷2 min。3） 離心數(shù)秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。4） 在上述Eppendorf管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應液:試劑名稱 使用量上述模板RNA/引物等的混合液 10 l5Frist-Stand Buffer 4 lRNase Inhibitor(40 U/ l) 0.5 lMTV RTase (10 U/l) 0.5 lRNase free dH2O up to 20

7、 l5） 37 保溫60 min。6） 95 ,5 min后冰上冷卻，得到的cDNA溶液用于PCR擴增。1.2小麥胚及胚乳總RNA的提?。?）配制RNA抽提buffer，50 ml中含有：1M Tris-HCl（PH 9.0） 2.5 ml4MNaCl 1.5 ml10%SDS 5 mlDEPC-H2O 41.25 ml（2）取以上RNA提取液650 ul，加350 ul水飽和酚，放入1.5 ml離心管中，65 水浴預熱。（3）研磨0.3 g材料，直至呈粉末狀，待液氮剛剛揮發(fā)，迅速加入到上述預熱的提取液中，立即劇烈震蕩，約10 min。（4）再加入400ul氯仿，抽提10 min，12000r

8、pm 4 離心10 min。（5）取上清，加入等體積的氯仿，混勻搖10 min，12000rpm 4離心10 min。（6）取上清，加1/3體積的8 M氯化鋰，4 保存過夜。（7）離心10 min，棄上清液，留沉淀，用75%乙醇洗1次，再用無水乙醇洗5-10 s，晾干，溶于80 ul DEPC水中。（8）加入9 ul DNA酶(無RNA酶)，10 ul 10buffer（DNA酶所帶）和1 ulRasin（Rnas抑制劑），37 30分鐘（再加500 ul水）（9）取出用 300 ul氯仿和 300 ul苯酚抽提，搖10 min鐘，靜止10 min，12000 rpm 4 離心10 min。（

9、10）取上清，加入等體積的氯仿，搖10 min，靜止10 min，4 離心10 min。（11）取上清，加1/10 NaAC（3M，PH 5.2），再加2倍體積的預冷無水乙醇， -80 冰箱過夜；（10）12000rpm離心15 min，棄上清液，留沉淀，晾干，溶于40 ul DEPC水中，電泳檢測其完整性，保存于-80，備用。 2.2.2.1 cDNA第一條鏈的合成（1） 基因組DNA的去除反應試劑 使用量5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ulgDNA Eraser 1.0 ul Total RNA 5 ulRNase Free dH2O up to 10.0 ul 42 2

10、 min 4 10 min(2) 反轉(zhuǎn)錄反應試劑 使用量5xPrimeScriptBuffer 2(for Real Time) 4.0 ulPrimeScriptRT Enzyme MixI 1.0 ulRT Prime Mix 1.0 ul的反應液 10.0 ulRNase Free dH2O up to 20.0 ul 37 15 min 85 5 sec 4 10 min -20 保存?zhèn)溆?.基因cDNA克隆2.1基因片段的PCR擴增 以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為20ul：10PCR Buffer 2.0 ul，2.5 mM dNTPs 1.6 ul，10

11、 mM上下游引物各0.8 ul，Taq 酶0.3 ul，模板cDNA1.0 ul，ddH2O補足至20 ul。按照下列條件進行PCR擴增： 94 4 min 94 30 sec 50 40 sec 30 cycles 72 1 min 72 10 min 2.2 PCR擴增產(chǎn)物的檢測和回收純化PCR擴增產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠(含有 0.5 ug/ml溴化乙錠)上進行電泳，在紫外燈照射下進行觀察，與標準分子量進行比較估測擴增DNA片段的大小，若與預計的大小相符，則使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將擴增出的片段回收，主要操作步驟如下：1) 在紫外燈下切下將要回收的條帶(盡量使用長波長的UV)，稱重。

12、2) 按每 100 mg 瓊脂糖膠加入300 ul溶膠液PN，置于50 水浴中 10 min，每隔2 min混勻一次，使膠徹底融化，室溫放置2 min。3) 將UNIQ-10柱放入2 ml的收集管中，加入600 ul平衡液BL，13000rpm，離心30 sec。3) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的平衡液，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱中，靜止2-3 min，13000rpm，離心30 sec。4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，再放回收集管中，加入700 ul漂洗液PW(使用前先檢查是否已加入無水乙醇)，13000rpm離心30 sec。5) 取下UNIQ-10柱，倒

13、掉收集管中的廢液，放回收集管中，加入 500 ul漂洗液PW，13000 rpm離心30 sec，重復一次。6) 取下UNIQ-10柱，倒掉廢液，放回收集管中,13000rpm，離心2 min。7) 將UNIQ-10柱放入一新的1.5 mlEp管中，在柱子的吸附膜中央懸空滴加50 ul預熱70洗脫液EB，室溫放置5 min。8) 12000 rpm，離心l min，Ep管中液體即為回收的DNA片段，-20保存?zhèn)溆谩?.3 回收產(chǎn)物與PMD-T載體的連接與轉(zhuǎn)化 采用TAKARA公司的PMD-T載體進行連接反應，感受態(tài)細胞DH5a作為轉(zhuǎn)化細胞進行轉(zhuǎn)化。具體操作步驟如下： SolutionI、PMD

14、18-T或19-T、DNA回收產(chǎn)物置于冰中溶解。 在0.2ml離心管中配制反應體系10ul： PMD18-T 載體 0.5 ul SolutionI 5 ul 回收DNA產(chǎn)物 4.5 ul 混勻，16 反應過夜（3h就可以）。 連接反應快結(jié)束時，從-80 冰箱中取出DH5a感受態(tài)細胞，將離心管置于冰上使之融化。1）取5 ul 的連接產(chǎn)物加到50 ul 感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30 min。2）將離心管置于42 水浴90 s，間不要搖動離心管。取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，其3）向離心管中加入600-900 ul LB（不含抗生素）液體培養(yǎng)基，150r/min，37震蕩培養(yǎng)60

15、min。4）吸取150 ul 已搖好的菌液涂布在含有Amp(終濃度50 ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，待液體完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置平板，37，培養(yǎng)12-14小時。2.4重組克隆的驗證及序列測定 隨機挑選5個左右單菌落于10 ml含50 ug/ml的LB液體培養(yǎng)基中，于恒溫搖床37 C，180r/min震蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)至菌液OD600為0.60.8，用天根的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。也可按照下列步驟提取質(zhì)粒：1）將培養(yǎng)好的菌液倒入2.0 ml 離心管中，12000rpm離心1min，去掉上清液，再重復二次。2）加入100 ul預冷的溶液P1渦旋使充分懸浮，室溫靜止5 min。3）加入200

16、ul溶液P2，同一方向緩慢勻速轉(zhuǎn)動離心管使溶液混合均勻，置冰上5 min。4）加入150 ul溶液P3，同一方向緩慢勻速轉(zhuǎn)動離心管使內(nèi)含物在溶液中分散均勻，置冰上5 min。5）12000 rpm，離心10 min，取上清，用等體積的苯酚和氯仿:異戊醇(24:l)，各抽提一次。6）12000 rpm，離心3 min，取上清。7）向上清中加入2倍體積的無水乙醇，混勻，-20，放置30 min，12000 rpm，離心10 min。8）棄上清，加入l ml75%乙醇，洗滌沉淀，12000 rpm離心3 min，棄上清，自然晾干。9) 每管中加入30 ul TE (pH 8.0) buffer和1

17、lRNase(10ug/ul )，37水浴30 min溶解質(zhì)粒DNA,-20貯存?zhèn)溆?。溶液的配制：SolutionI:葡萄糖50 mM; EDTA(PH8.0) 10 mM;Tris-Hcl 25 mM SolutionII:NaOH 0.2 M;SDS 1%(現(xiàn)用現(xiàn)配) SolutionIII:乙酸鉀 60 mM;冰乙酸 11.5 ml;ddH2O 28.5 ml采用上文中的P1、P2特異性引物以質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增結(jié)果與RT-PCR相同的質(zhì)粒為驗證的陽性質(zhì)粒，由華大基因工程有限公司進行序列測定。二、植物轉(zhuǎn)化表達載體的構(gòu)建 事前三問a.構(gòu)建什么載體（過表達，干擾？還是別的）？酶切位

18、點有哪些是可以用的？怎么用方便？b.載體的細菌抗性和篩選抗性分別是什么？c.準備轉(zhuǎn)到哪種材料里？用什么方法轉(zhuǎn)？ 實驗前準備工作 a.選擇一個合適的表達載體 b.酶切位點選擇：用DNAMAN中的Restriction-Restriction Analysis 分析待插入基因中包含的酶切位點，避免使用基因中已有的酶切位點。剩下的酶切位點的選擇依據(jù)的原則為：方便（酶反應溫度、Buffer一樣，可以雙酶切）、快捷（可以省時酶切）、便宜。 c.設計帶酶切位點的引物d.購置試劑：高保真酶或LA Taq酶、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA連接試劑盒等e.實驗試劑及用具：槍頭、離心管、培養(yǎng)皿、濾紙滅菌；

19、Amp+ 、Kan+等抗生素 基本流程 a.過表達載體酶切#：如果兩個酶可以同時酶切，就直接雙酶切；如果不能，按以下方法進行以NcoI和BstEII為例和：1）取一滅菌的200ul的離心管按順序依次加入：10Buffer 2 ul NcoI 1 ulPlasmid 2-3 ulddH2O 補足20 ul2) 混勻，37水浴3 h，再向管中加入2倍體積的無水乙醇，4放置1 h，12000 rpm離心10 min，75%的酒精洗滌一次，晾干，再向離心管中分別加入：10Buffer 2 ulBstEII 1 ulddH2O 17 ul3) 混勻，60 水浴3h后用1.2的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將所需要

20、的目的片段在紫外光下切下來，用瓊脂糖DNA回收凝膠劑盒回收純化小片段。同時用同樣的方法酶切表達載體（如PCAMBIA3301），回收大片段。b.RNA干擾載體的構(gòu)建三、 功能驗證目前本實驗基因的功能驗證主要采取轉(zhuǎn)基因的方法，常用的轉(zhuǎn)基因方法有基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導法。目前實驗室做的是農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻。下面把兩種方法都介紹一下： 實驗前準備工作 a. 準備好誘導愈傷的材料（我們用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥莖尖用豫麥34，轉(zhuǎn)化水稻愈傷用kitake；用基因槍法一般用豫麥18）。 b.準備好配制各種組培培養(yǎng)基的試劑和藥品。 c.準備好光照恒溫培養(yǎng)箱。 基本流程（農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻） 種子消毒 誘導

21、愈傷（30d左右）共培培養(yǎng)（3d）恢復培養(yǎng)（7d） 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化重組載體 篩選培養(yǎng)（30d以上） 分化培養(yǎng)（90d左右）移栽到花盆至成熟農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻1. 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備轉(zhuǎn)化1) 取出-80 保存的含農(nóng)桿菌菌株EHA105的菌液冰上解凍，劃線接菌于YEB固體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/L）中，28 恒溫培養(yǎng)2天。2) 挑取農(nóng)桿菌EHA105單克隆，接種于10 ml YEB液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/L）中，于恒溫搖床中28 、200rpm/min培養(yǎng)1-2天。3) 在250 ml的三角瓶中加入50 mlYEP液體培養(yǎng)基及上述過夜培養(yǎng)物的菌液2 ml，200 rpm/ min

22、，28培養(yǎng)至OD600為0.5-1。4) 冰浴冷卻菌液，4000rpm，4，5-10 min離心收集菌體。5) 去上清，沉淀懸浮于1 ml預冷的0.15 mol/L CaCl2中，使細胞充分懸浮，分裝成100 l/管，每管中加入100 ul預冷的50%甘油，液氮中速凍后至-80 保存。6） 每管加入約1 g構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，混勻冰上放置30 min。7） 液氮中速凍1 min。8） 迅速置于37 水浴鍋中，水浴5 min。9） 加600 ul YEP液體培養(yǎng)基，28 ，50rpm慢搖2-4 h，使抗性基因得到表達。10） 于超凈工作臺上將菌液涂布于YEP固體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/L，

23、Kan 50mg/L），同時設置一個僅含抗生素的平板做對照。11） 于28 恒溫培養(yǎng)箱中2-3 d后檢測其生長情況。12） 挑取單菌落進行培養(yǎng)提取質(zhì)粒，并且進行酶切鑒定。附：YEB 培養(yǎng)基的制備YEP液體（500ml）YEP固體（500ml）YEAST EXTRACT5.0g5.0gTPYPTONE5.0g5.0gBEEF EXTRACT2.5g2.5gAGAR POWDER0.0g1.5g/100ml滅菌：121，20min2水稻基本培養(yǎng)基的配制 表2-1 水稻基本培養(yǎng)基的配制 Table 2-1 Preparing the minimal medium of rice 單位：mg/L成份N

24、6-P mediumN6-AS mediumN6-R mediumMS-F mediumN6 salt mixtureMSsalt mixtureCoCl2H2OCuSO45H2ONaMoO42 H2OGlycineMyo-inositolThiamine HCIPyridoxineNicotinicProlineCasamino acidSucrose2,4-DSorbitolKinetinNAAGelritepH3,981/0.0250.0250.2521005112,80030030,0002/4,0005.63,981/0.0250.0250.252100511/1,000 30,00

25、02/4,0005.63,981/0.0250.0250.252100511/1,00025,000/25,00020.058,0005.6/1,000/2100511/15,000/2,5005.63.根癌農(nóng)桿菌介導水稻轉(zhuǎn)化3.1 種子消毒和愈傷組織的誘導1）選取成熟飽滿健康的水稻種子去殼后，75%的乙醇消毒1 min，無菌水漂洗3次，用20的次氯酸鈉溶液消毒20 min，無菌水漂洗5次。2）將種子種胚朝下放置到N6-P固體基本培養(yǎng)基上，28 ，光照（12h）/ 黑暗(12 h)，冷光條件下培養(yǎng)30天左右。3.2 農(nóng)桿菌介導水稻轉(zhuǎn)化以農(nóng)桿菌菌株EHA105為介導，分別將構(gòu)建好的表達載體導入受

26、體材料Kitaake，并獲得相應的轉(zhuǎn)基因植株。水稻成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的基本流程為：1）28 培養(yǎng)以上含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌16 h，收集菌體，并稀釋到含有100 mol/L AS的N6液體培養(yǎng)基中至濃度為OD6000.5；2）將適量培養(yǎng)至一個月的水稻成熟胚胚性愈傷組織與上述菌液混合侵染30 min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，24 共培養(yǎng)3 d；3）將上述愈傷接種在含有3 mg/L Bialaphos（或潮霉素）的N6固體篩選培養(yǎng)基上第一次篩選16 d；4）挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入5 mg/L bialaphos的N6固體篩選培養(yǎng)基上第二次篩選，每15 d繼代一次；5）挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進行分

27、化培養(yǎng)；6）待分化成苗的再生水稻植株長至20 cm高時（約90 d）開口煉苗3 d，并移栽至溫室栽培。4 轉(zhuǎn)基因植株的初步鑒定4.1 轉(zhuǎn)基因水稻DNA的提取按上述方法用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因水稻株系總DNA，并按順序記號編號4.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測以提取的DNA為模板，用引物P1、P2進行PCR檢測，同時用提取的重組質(zhì)粒做陽性對照，以水和未轉(zhuǎn)化的水稻kitaake為陰性對照，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上檢測目的條帶是否存在，以確定轉(zhuǎn)基因的個體。5 外援目的基因的表達分析為了檢測外源性目的基因是否在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄表達，及其在組織部位的表達量，選取已鑒定為陽性植株的轉(zhuǎn)基因水稻株系，在花后10

28、d分別取根、莖、葉及未成熟胚乳總RNA，用Actin為內(nèi)參，進行定量RT-PCR檢測。6種子萌發(fā)實驗將經(jīng)PCR鑒定的轉(zhuǎn)基因株系種子（T1）收獲后與同非轉(zhuǎn)基因水稻品種在相同的條件下萌發(fā)實驗，一周之后觀察種子發(fā)芽情況。為進一步研究該基因水稻種子萌發(fā)特性的變化及ABA和脅迫條件下的反應，選取經(jīng)分子鑒定為穩(wěn)定遺傳的健康轉(zhuǎn)基因種子（T2），50打破休眠，采用不同濃度的ABA溶液，以及75 mmol/LNaCl和200 mmol/L甘露醇溶液浸泡種子，觀察記錄其萌發(fā)?；驑屴Z擊法轉(zhuǎn)小麥1.培養(yǎng)基的配制1）愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基2 mg/L 2,4-D30 g/L蔗糖7 g瓊脂/L，pH為5

29、.6-5.8。在此培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前兩周附加0.5 mg/L ABA2）高滲培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基2 mg/L 2,4-D0.4 mol/L甘露醇30 g/L蔗糖7 g瓊脂/L，pH為5.6-5.83）分化篩選培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+3-5 mg/L bialaphos+0.7%瓊脂+3%蔗糖， pH5.6-5.84） 生根篩選培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基+0.5 mg/L IAA+1-2 mg/L bialaphos+1.5 mg/L多效唑+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH5.6-5.8以上所有培養(yǎng)基均采用常規(guī)方法滅菌，選擇劑Bialaphos及激素均采

30、用過濾滅菌，培養(yǎng)基冷卻至60 左右時加入。2.微彈的制備稱取50 mg金粉(直徑為1.0 um)放入1.5ml離心管中，加入1 ml 96%的酒精充分振蕩30 s，使金粉充分散開，12000rpm離心1 min，除去上清液，再加1 ml 96%乙醇重懸金粉，重復上述步驟3次。至完全除去乙醇后，加入1 ml無菌水制成濃度為50 mg/ml的金粉懸浮液，用前吸取50 ul金粉懸浮液至Eppendorf管中，加入質(zhì)粒DNA 5 ul（1 ug/ul），振蕩混勻，再依次加入50 ul 2.5 mol/L的CaCl2和20 ul 0.1 mol/L的亞精胺(spermidine現(xiàn)用現(xiàn)配)溶液混勻，然后冰