1、第六章細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè),主要內(nèi)容,細(xì)胞工程的概念、研究范疇 植物細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞拆合技術(shù),第一節(jié)、概述,利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用工程學(xué)的方法，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，從而獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物品種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。,概念,1 細(xì)胞工程的概念及研究范疇,研究范疇,動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng) 植物細(xì)胞與組織培養(yǎng) 細(xì)胞融合 細(xì)胞核移植（細(xì)胞拆合） 染色體工程 胚胎工程 干細(xì)胞與組織工程 細(xì)胞生物反應(yīng)器,1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù),2）動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù),3）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)）,4） 細(xì)胞拆合核移植技術(shù),5）染色體工程

2、技術(shù),染色體工程是按人們的需要來添加、削減或替換生物的染色體從而定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。主要分為動(dòng)物染色體工程和植物染色體工程,6）胚胎工程技術(shù),7）干細(xì)胞和組織工程,8）細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,2、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用,紫杉醇(taxol)是從紅豆杉屬(Taxus L.)植物中分離出的一個(gè)具有獨(dú)特抗腫瘤活性的二萜類化合物，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療卵巢癌和乳腺癌。,三、動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用,1.在疫苗生產(chǎn)上的應(yīng)用 。 將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。,2. 生產(chǎn)單克隆抗體 單克隆抗體可以檢測(cè)出多種病毒中非常細(xì)微的株間差異，鑒定細(xì)菌的種型和亞種。 3

3、.繁育優(yōu)良品種。 目前，人工受精、胚胎移植等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。 4. 在干擾素生產(chǎn)上的應(yīng)用,是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的生長(zhǎng)、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過程中不再形成組織的一項(xiàng)技術(shù)。,細(xì)胞培養(yǎng),第二節(jié)、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),一、 植物細(xì)胞工程的發(fā)展,細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立：18381839年間由德國(guó)的植物學(xué)家施萊登（Schleiden）和動(dòng)物學(xué)家施旺（Schwann）所提出,直到1858年才較完善。,理論基礎(chǔ)和探索,1902年，德國(guó)著名植物生理學(xué)家Haberlandt, 提出細(xì)胞全能性學(xué)說，并首次進(jìn)行高等植物的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，但細(xì)胞未能發(fā)生細(xì)胞分裂和增殖。,1756年，Moncean首先

4、發(fā)現(xiàn)植物在受傷愈合的組織皮層能產(chǎn)生芽，因而預(yù)言這一途徑可以成為一種繁殖方式,培養(yǎng)技術(shù)建立,植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用發(fā)展,20世紀(jì)40年代：J.Bonner 銀膠菊組織培養(yǎng)生產(chǎn)橡膠。 20世紀(jì)70年代：植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成份。 20世紀(jì)80年代：400多種植物，600多種代謝產(chǎn)物。40多種植物次生代謝產(chǎn)物達(dá)到或超過植株產(chǎn)量。 20世紀(jì)90年代：1000多種植物。,1.首先，要取材和除菌。用一定的化學(xué)試劑對(duì)材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面清洗、消毒。有時(shí)還要借助某些特定的酶，對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，以期得到分散生長(zhǎng)的細(xì)胞。 常用的消毒滅菌劑:效果較好的有幾種化學(xué)試劑，如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。,二、細(xì)胞培養(yǎng)一般步

5、驟,2.其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌或除菌。采用無菌操作技術(shù)，將生物材料接種于培養(yǎng)基中。,3. 最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，提供各類細(xì)胞生長(zhǎng)所需的最佳培養(yǎng)條件。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)應(yīng)及時(shí)收獲或傳代。,三.植物細(xì)胞培養(yǎng)基,植物細(xì)胞的培養(yǎng)基:通常包括無機(jī)鹽、碳源、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、有機(jī)添加劑等。,用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分基本上與整個(gè)植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求,無機(jī)鹽：有不少鹽可用來提供“大量元素”和“微量元素”，表中給出了常用培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量。,培養(yǎng)中的細(xì)胞對(duì)蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的

6、利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。,碳源和能源,培養(yǎng)中的植物細(xì)胞都需要硫胺素，加入煙酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。,維生素,雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產(chǎn)物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有機(jī)添加劑還有如乳蛋白水解物，酵母提取物等,氨基酸,激素分為兩類，生長(zhǎng)素和分裂素。生長(zhǎng)素促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多

7、的是6-芐氨基嘌呤和玉米素，對(duì)芽的誘導(dǎo)具有重要作用。分裂素和生長(zhǎng)素通常一起使用，來促進(jìn)細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)。,植物生長(zhǎng)激素,四.愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),愈傷組織：是指外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散的排列的薄壁細(xì)胞，是分化的，而且還未形成組織的結(jié)構(gòu)。,外植體：是指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體培養(yǎng)的植物材料。,愈傷組織的誘導(dǎo),選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉 選擇適宜的培養(yǎng)基：MS，B5，N6 較高激素濃度 豐富的有機(jī)附加物。 培養(yǎng)基中有較高含量的無機(jī)氮源 較低的蔗糖濃度 適當(dāng)縮短繼代培養(yǎng)的間隔時(shí)間有利于疏松易碎愈傷組織的形成。,要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈

8、鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎,適宜懸浮培養(yǎng),適宜再生植株,懸浮系的建立與培養(yǎng),callus,150250ml flask,centrifuge isolation,subculture,1g/10ml medium,100120 rmp culture transfer 1 time/3d,80 rpm,高表達(dá)細(xì)胞系的篩選建立,一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤鮮艷 二是均一性好 三是生長(zhǎng)速度快、次生代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng),五.單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),機(jī)械法,將葉肉組織研碎，經(jīng)過濾和離心，收集和凈化細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：不受酶的傷害，有利于細(xì)胞生理和生化研究。缺點(diǎn)：手工操作難度大，獲得完整的細(xì)胞

9、數(shù)量少。,1、單細(xì)胞分離方法,酶法,利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他外植物體，使細(xì)胞分離。 加滲透壓保護(hù)劑如甘露醇以防酶對(duì)細(xì)胞的損傷。 加硫酸葡聚糖鉀鹽可提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量。,化學(xué)法,利用利用化學(xué)藥劑使細(xì)胞分離的方法。 草酸鈣處理胡蘿卜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，可獲得分散細(xì)胞。 秋水仙堿、2，4D或LH。,看護(hù)培養(yǎng),2、單細(xì)胞培養(yǎng)方法,用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。,優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)便易行，效果好。 缺點(diǎn)： 不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)過程。,將懸浮單細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。,平板培養(yǎng),平板培養(yǎng),平板培養(yǎng)植板率,優(yōu)點(diǎn)： 單細(xì)胞在

10、培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察。篩選效率高、篩選量大、操作簡(jiǎn)便。 缺點(diǎn)： 通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成 毒害或影響組織吸收。,微室培養(yǎng),在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。,置培養(yǎng)皿中2628 恒溫培養(yǎng),優(yōu)點(diǎn)： 可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂、分化等過程。 缺點(diǎn)： 培養(yǎng)基少，營(yíng)養(yǎng)和水分難以保持，pH變動(dòng)幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。,六.提高植物細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的方法,加入前體物或誘導(dǎo)物,前體物：次生代謝合成途徑中的某一中間化合物或是合成的起始物。 誘導(dǎo)物：一類能引起植物細(xì)胞代謝強(qiáng)度變化或代謝

11、途徑改變的物質(zhì)。,毛狀根培養(yǎng),毛狀根(hairy roots)是發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其Ri質(zhì)粒上的TDNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。,冠癭瘤培養(yǎng),植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用,（1）利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料 （2）生產(chǎn)食品添加劑 （3）生產(chǎn)天然食品,七、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn),植物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。 植物細(xì)胞培養(yǎng)通常形成細(xì)胞團(tuán)。 植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng) 多泡沫。 植物細(xì)胞在高濃度培養(yǎng)時(shí)為假塑性流體。 植物細(xì)胞的需氧量要比微生物要低的多。 大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)需要光照。,幾種流體

12、特征,1-賓漢型 2-假塑性 3-牛頓型 4-漲塑性 1-漲塑性 2-牛頓型 3-假塑性,1.植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng),懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢(shì),把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng),1）培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸面大，傳質(zhì)效果好。 2）可帶走有害的代謝產(chǎn)物，避免了有害產(chǎn)物局部濃度過高的問題。 3）能充分保證氧的供給。,2.植物細(xì)胞固定化培養(yǎng),植物細(xì)胞固定化是將植物細(xì)胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進(jìn)行培養(yǎng)，并生產(chǎn)有用代謝物的技術(shù)。,固定化培養(yǎng)技術(shù),（1）有利于次生物質(zhì)的合成、積累； （2）減弱剪切力損傷； （3）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產(chǎn)物的收集；,固定化培養(yǎng)優(yōu)勢(shì),1）懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器,植物

13、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（20世紀(jì)70年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機(jī)械攪拌反應(yīng)器。,1972年，Kato首先用機(jī)械攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)煙草細(xì)胞以獲取煙堿。Fujita利用這種反應(yīng)器生產(chǎn)紫草寧。,3.植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器,機(jī)械攪拌反應(yīng)器,機(jī)械攪拌植物細(xì)胞反應(yīng)器,機(jī)械攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題,優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器最大的優(yōu)點(diǎn)就是獲得高的溶氧系數(shù) (KLa 100h-1)，植物細(xì)胞培養(yǎng)一般只需要KLa在5-20 h-1之間就夠了；再是反應(yīng)器的溫度、pH值、溶氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度較易控制。,存在的問題：主要問題是剪切力問題；對(duì)只需較低kLa的植物細(xì)胞培養(yǎng)，促進(jìn)氧傳遞的機(jī)械攪拌，每單位體積消耗的功率比氣體

14、攪拌要大；機(jī)械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了無菌密封問題。,非機(jī)械攪拌反應(yīng)器,通常為氣體攪拌反應(yīng)器，是一種利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓泡式反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器，氣升式反應(yīng)器又可分為外循環(huán)和內(nèi)循環(huán)式。,我國(guó)的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了“氣升內(nèi)錯(cuò)流式”植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器用于培養(yǎng)紫草，紫草寧含量達(dá)到了干細(xì)胞重的10%，是天然植株的2-8倍。,氣體攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題,優(yōu)點(diǎn)：剪切力小，對(duì)植物細(xì)胞損傷小；因沒有攪拌軸而更易保持無菌；操作費(fèi)用低。,不足：因氣體攪拌強(qiáng)度低，高密度培養(yǎng)時(shí)混合不夠均勻?？看罅康耐廨斎雱?dòng)量和能量，以保證反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的良好傳質(zhì)、傳熱。但過量的通氣易排除培養(yǎng)液

15、中的二氧化碳和乙烯，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)有阻礙作用。再是過高的溶氧對(duì)植物細(xì)胞合成次級(jí)代謝產(chǎn)物不利。,2)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器,固定化細(xì)胞：將一定生理功能的生物體用物理或化學(xué)方法使其與適當(dāng)載體相結(jié)合，作為固體催化劑利用。,優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)挝惑w積細(xì)胞多，受剪切力小。 缺點(diǎn)：由于其混合效果低，對(duì)必要的氧傳遞，pH值、溫度控制和氣體產(chǎn)物(如C02)的排除造成了困難。再者支持物顆粒破碎易堵塞填充床。,填充床反應(yīng)器,Jones 在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行了固定化胡蘿卜的培養(yǎng)，Kargi 采用這種反應(yīng)器培養(yǎng)長(zhǎng)春花,流化床反應(yīng)器,優(yōu)點(diǎn)：良好的傳質(zhì)特性。 缺點(diǎn)：剪切力和顆粒碰撞會(huì)損壞固定化細(xì)胞，同時(shí)，流體動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性使之難以放大。

16、,典型的流化床反應(yīng)器是利用液體或氣體的流動(dòng)使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。,Hamilton 用之培養(yǎng)胡蘿卜細(xì)胞，研究了轉(zhuǎn)化酶活性。,膜反應(yīng)器,優(yōu)點(diǎn)：可以重復(fù)使用。另外，流體易控制，易放大，而且能提供更均勻的環(huán)境條件。膜具有選擇性，有利于產(chǎn)品分離。 缺點(diǎn)是構(gòu)建膜反應(yīng)器的成本較高。,第三節(jié)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),19世紀(jì)30年代，Muller, Schwann, Virchow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細(xì)胞現(xiàn)象。 1849年Lobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在，1855年1858年，科學(xué)家們?cè)诜谓M織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞。,1融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),一、動(dòng)

17、物物細(xì)胞工程的發(fā)展,1859年，A. Barli在研究黏蟲的生活史時(shí)發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個(gè)核細(xì)胞融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞彼此融合而形成的。,2. 動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立,1907年，R. Harrison將蛙的胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織存活了若干星期，而且還長(zhǎng)出了軸突(神經(jīng)纖維)細(xì)胞。 Carrel (1911)發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對(duì)于某些細(xì)胞的生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的促進(jìn)效應(yīng)，把無菌技術(shù)引到了組織培養(yǎng)技術(shù)中。,1914年，Thomson創(chuàng)立了器官培養(yǎng)法，以后被Strangeways和Fell所發(fā)展。 1940年，Earle建立了小鼠的

18、結(jié)締組織細(xì)胞系L系。1951年，Gay建立了第一個(gè)人體細(xì)胞系.,3. 細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生,1958年, Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的仙臺(tái)病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。 Harris(1965)誘導(dǎo)不同的動(dòng)物體細(xì)胞融合獲得成功。,Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用選擇性培養(yǎng)基篩選異型融合細(xì)胞，并能不斷地增殖。 1975年，免疫學(xué)家Kohler和Milstein利用小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。,4. 動(dòng)物克隆技術(shù)的建立,1891，Heape等人首次報(bào)道了家兔胚胎移植成功的結(jié)果。 20世紀(jì)30年代以后，先后在羊、豬、牛

19、等動(dòng)物的胚胎移植上獲得成功。,1962年，英國(guó)學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有1的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。 1997年2月，英國(guó)科學(xué)家Wilmut等報(bào)道了世界第一只克隆羊的誕生。,1.過程,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),2.幾個(gè)概念：,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。,原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng),用胰蛋白酶將出現(xiàn)接觸抑制的貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細(xì)胞懸液，分裝到多個(gè)培養(yǎng)

20、瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個(gè)過程叫傳代培養(yǎng)。,細(xì)胞系和細(xì)胞株,初次培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)第一次傳代成功后，即稱之為細(xì)胞系。,從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。,有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系,大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)增殖，當(dāng)超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成無限細(xì)胞系或稱連續(xù)細(xì)胞系。 有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期，其轉(zhuǎn)換過程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化。,接觸抑制,密度抑制,3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)的特點(diǎn),貼附生長(zhǎng),貼附生長(zhǎng),粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在

21、懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。,細(xì)胞接觸抑制,細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過程中，細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停止的現(xiàn)象。,密度抑制,細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞密度增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響而導(dǎo)致的細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停止。,體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同,細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異,上皮細(xì)胞型 成纖維細(xì)胞型 游走細(xì)胞型 多型性細(xì)胞型,4、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞形態(tài),類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形

22、核。彼此緊密相連成鋪石狀薄層；生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)；很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),上皮細(xì)胞型,胞體梭形或不規(guī)則三角形；胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長(zhǎng)短不等的細(xì)胞突起；中有卵圓形核。排列成放射狀，漩渦狀，不連成片。,成纖維細(xì)胞型,游走細(xì)胞型,外形不規(guī)則且不斷變化，細(xì)胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆粒。生長(zhǎng)位置不固定，分散，呈活躍的的游走和變形運(yùn)動(dòng)。,多型性細(xì)胞型,外形不規(guī)則，細(xì)胞由略呈多角形的胞體和細(xì)長(zhǎng)的、類似偽足的胞突兩部分組成，胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆粒,血清：如Hela細(xì)胞系在高血清成纖維細(xì)胞樣；低血清上皮樣細(xì)胞 pH：如Hela細(xì)胞系，太酸或太堿成纖維細(xì)胞樣；標(biāo)準(zhǔn)pH上皮樣細(xì)胞細(xì)胞密度：3T3，低密度成纖維細(xì)胞樣

23、；高密度上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)改變：懸浮圓形懸浮；貼附成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否 ：未轉(zhuǎn)化成纖維樣；轉(zhuǎn)化后可成上皮樣,培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)變化,三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程,1.培養(yǎng)細(xì)胞生命期,所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。,正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期,2.體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期-生長(zhǎng)曲線,潛伏期 指數(shù)增長(zhǎng)期 平衡期 衰退期,所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。,四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù),1. 無菌、無毒的環(huán)境,添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。,2. 溫度和pH,溫度 pH,與體內(nèi)相近 35-37,7.27.4,3. 氣體環(huán)境

24、,O2 CO2,細(xì)胞代謝所必需,維持pH,CO2培養(yǎng)箱（95% 空氣5% CO2 ）,5 .平衡鹽溶液BSS,人工合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)用液，用來洗滌細(xì)胞。 Hanks液、Earle液和PBS液等,4. 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽、微量元素、激素以及動(dòng)物或人血清等。,RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基成分 （配制時(shí)添加碳酸氫鈉2000mg/L）,五、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),培養(yǎng)方式分為： 分批式 流加式 半連續(xù)式 連續(xù)式,1.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式,分批式培養(yǎng),分批式培養(yǎng)：指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物不斷形成，經(jīng)一段時(shí)間后，終止培養(yǎng)。,特點(diǎn)： 分批式培養(yǎng)

25、過程的環(huán)境隨時(shí)間變化很大 細(xì)胞的生長(zhǎng)階段可分為延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。,流加式培養(yǎng),特點(diǎn)： 可避免某種營(yíng)養(yǎng)成分的初始濃度過高； 能防止?fàn)I養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡； 整個(gè)過程反應(yīng)體積是變化的。,流加式培養(yǎng)是指先將終體積1/31/2的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)養(yǎng)成分又不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)代謝，到反應(yīng)終止時(shí)取出整個(gè)反應(yīng)系。,半連續(xù)式培養(yǎng),指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用。,

26、特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)期生產(chǎn)，細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高水平。,連續(xù)式培養(yǎng),連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補(bǔ)充，保持反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。 特點(diǎn)： （1）反應(yīng)器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細(xì)胞在優(yōu)化狀態(tài)下生長(zhǎng)；（2）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)； (3)操作復(fù)雜、增加污染機(jī)會(huì)、細(xì)胞變異、設(shè)備儀器要求高,2、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),懸浮培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng) 固定化培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)技術(shù) 大載體培養(yǎng)技術(shù) 多孔載體培養(yǎng) 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù),是指在外力的作用下，兩個(gè)以上的異源（種、屬）細(xì)胞或原生質(zhì)體互相接觸，不

27、經(jīng)過有性過程而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成一個(gè)雜合細(xì)胞的現(xiàn)象。,細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）,白菜,甘藍(lán),白菜甘藍(lán),植物體細(xì)胞融合應(yīng)用示例,雜交的兩個(gè)細(xì)胞,再生細(xì)胞壁,雜種細(xì)胞,脫分化,再分化,（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）,植物細(xì)胞融合,植物組織培養(yǎng),細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，然后，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞開始細(xì)胞質(zhì)融合，然后在培養(yǎng)過程中，進(jìn)而發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞。,細(xì)胞融合的過程,細(xì)胞融合,一.誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法,1、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合,病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙臺(tái)病毒最常用。 用作融合劑的病毒必須事先用

28、紫外線或-丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。,兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近，使兩個(gè)細(xì)胞膜、胞質(zhì)間互相滲透 、細(xì)胞核互相融合，進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，形成雜種細(xì)胞。,機(jī)制,優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，適宜各種動(dòng)物細(xì)胞，且仙臺(tái)病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)； 缺點(diǎn)：仙臺(tái)病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會(huì)降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾。,病毒誘導(dǎo)融合優(yōu)缺點(diǎn),常用的病毒：（Sendal virus), 又稱日本血凝病毒 （Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） 屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓

29、球形， 1962年，日本仙臺(tái)東北大學(xué)學(xué)者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,仙臺(tái)病毒,利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。,2、化學(xué)融合劑法,機(jī)制：PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚體,它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu), 使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組,此時(shí)相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能,從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合.。 優(yōu)缺點(diǎn):聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對(duì)有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞)不適用。,聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)融合,機(jī)制：一般認(rèn)為是Na+造成了膜電位的改變。存在的缺陷：就是融合頻率低，而且對(duì)于來源于

30、葉肉的高度液泡化的原生質(zhì)體有害。由NaNO3誘導(dǎo)的可重復(fù)、可控制的離體原生質(zhì)體融合是由Power等（1970）報(bào)道的。利用這一融合劑，Carlson等（1972）在植物中獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種，,NaNO3處理誘發(fā)融合,高Ca2+高pH誘發(fā)融合的機(jī)制尚不很清楚，一般認(rèn)為是改變了膜位及膜的物理結(jié)構(gòu)。煙草葉肉原生質(zhì)體在高Ca2+（0.05M CaCl2）和高pH（10.5）條件下能很快誘發(fā)融合（37），但融合頻率不很高，高pH也影響原生質(zhì)體的存活率，且易誘發(fā)多個(gè)原生質(zhì)體融合。,高pH高濃度鈣離子處理,1981年，Scheurich和Zimmermann發(fā)明了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合。 采用直流電脈沖的誘導(dǎo)，

31、可改變?cè)|(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷，使異種原生質(zhì)體粘合，并使原生質(zhì)膜瞬間破裂，相鄰的原生質(zhì)體連接、閉合、產(chǎn)生融合體。,3、電誘導(dǎo)細(xì)胞融合法,細(xì)胞電融合原理：,懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在交流電場(chǎng)中（1100MHz和1001000V/cm ），會(huì)向小電極移動(dòng)，并極化成偶極子，并沿電場(chǎng)方向排列成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖，即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。,+,-,+,-,+,-,+,-,-,+,偶極子,電誘導(dǎo)法原理,+,-,-,+,電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個(gè)膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。 融合：由于膜的可逆性電激穿，使原

32、生質(zhì)體發(fā)生融合。,電融合包括兩個(gè)步驟：,原生質(zhì)體電融合過程,1）在高頻電流電場(chǎng)下的相互接觸。 2）脈沖刺激后30s3)50秒后4）1.5分鐘后 5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。,優(yōu)點(diǎn)：融合率高，達(dá)7080，甚至100 可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合 可直接挑選雜種細(xì)胞 重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害?。谎b置精巧、方便簡(jiǎn)單；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強(qiáng)等。,缺點(diǎn)：必須購(gòu)置專用的細(xì)胞電融合設(shè)備。,電融合儀,激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合,光鑷的原理,光鑷牽拉單細(xì)胞運(yùn)動(dòng),光鑷輔助細(xì)胞融合,離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合,在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入、動(dòng)量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，

33、引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場(chǎng)的改變，據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)的細(xì)胞融合,二、植物細(xì)胞融合,原生質(zhì)體,原生質(zhì)體是指用特殊方法去除細(xì)胞壁后而形成的祼露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。,原生質(zhì)體,植物原生質(zhì)體的制備流程,原生質(zhì)體的分離,原生質(zhì)體的純化,鑒定,取材與消毒,洗滌,活力測(cè)定,1、取材與消毒,可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。,肥皂水70%酒精3%次氯酸鈉無菌水,先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。,缺點(diǎn)：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生

34、原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞作用。,2、原生質(zhì)體的分離,機(jī)械分離法,指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。,酶解分離法,優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。 缺點(diǎn)：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)。會(huì)影響所獲原生質(zhì)體的活力。,常用的酶種類,纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶Driselase）、果膠酶類（果膠酶和離析酶Macerozyme）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。,3、原生質(zhì)體的純化,采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生

35、質(zhì)體漂浮在液體表層的純化方法。,優(yōu)點(diǎn)：可以避免分離的原生質(zhì)體因震蕩被組織碎片撞擊而破損；所用藥品簡(jiǎn)單，成本低。 缺點(diǎn)：對(duì)離心力要求比較嚴(yán)格，掌握不好，原生質(zhì)體則不易漂浮。,飄浮法,沉降法（過濾離心法）,利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。 優(yōu)缺點(diǎn)： 純化原生質(zhì)體比較簡(jiǎn)單。 由于原生質(zhì)體沉積于試管底部，造成相互擠壓，常引起原生質(zhì)體的破碎。,不連續(xù)梯度法,又稱界面法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。 優(yōu)點(diǎn)：可以收集到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過程中

36、原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。,4、原生質(zhì)體活力測(cè)定形態(tài)識(shí)別,形態(tài)完整、富含細(xì)胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。,形態(tài)識(shí)別,熒光顯微鏡識(shí)別(FDA法),FDA (fluorescein diacetate) 不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細(xì)胞質(zhì)膜。活細(xì)胞內(nèi)FDA可以被內(nèi)酯酶水解為不能自由穿越質(zhì)膜的熒光素，在完整的活細(xì)胞內(nèi)積累。 使用濃度：0.01%,酚藏花紅染色法,酚藏花紅（0.1%) 能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。,有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取伊凡藍(lán)(Evans blue)(0.025%)這種染料，活細(xì)胞不攝取。,伊凡藍(lán)染色法,5、植物細(xì)胞融合,PEG法和電融合法比較合適,6、融合子的鑒別,根據(jù)兩親本