1、第六章 DNA損傷與修復(fù) DNA damage and repair,分子生物學(xué)研究中心,第一節(jié) DNA損傷的原因及后果,電離輻射,可見光,氧自由基,H+,烷化劑,8-oxoG,P/P,復(fù)制錯(cuò)誤,核苷類似物,mC,U,DNA 損傷類型,堿基脫落 堿基修飾 & 去氨基化,化學(xué)修飾 光損傷,鏈內(nèi)交聯(lián) DNA-蛋白質(zhì) 交聯(lián) DNA鏈斷裂,DNA 重組,缺失堿基位點(diǎn),化學(xué)損傷,甲基化,甲基化,甲基化,氧化損傷,氧化損傷,DNA受到大劑量紫外線照射時(shí)，形成二聚體,紫外線可引起DNA的交聯(lián), DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)。,電離輻射引起DNA損傷的機(jī)理,電離輻射引起DNA損傷的機(jī)制,自由基損害,損傷DNA修復(fù)系統(tǒng)

2、,MCI 假說,電離輻射引起DNA損傷的類型,產(chǎn)生 OH自由基，導(dǎo)致堿基變化,脫氧核糖分解,DNA鏈斷裂,DNA鏈、蛋白質(zhì)的交聯(lián),電離輻射導(dǎo)致DNA鏈的斷裂,單鏈斷裂： 無差錯(cuò)修復(fù) 雙鏈斷裂： 錯(cuò)誤修復(fù),烷化劑引起DNA損傷,堿基烷基化: GC AT,堿基脫落: 甲基磺酸甲酯可使鳥嘌呤7N烷基化，活化糖苷鍵，連接堿基與五碳糖間的共價(jià)鍵變?nèi)?，容易折斷缺失堿基，造成脫嘌呤作用。,導(dǎo)致DNA斷鏈: 磷酸二酯鍵上的氧被烷基化,導(dǎo)致DNA鏈交聯(lián),5-BrdU （酮式-A； 烯醇式-G）,堿基類似物、修飾劑對DNA的改變,亞硝酸鹽氧化脫氨 （CU）,羥胺脫甲基 （TC）,黃曲霉素B （攻擊堿基）,DNA自

3、發(fā)性損傷,堿基錯(cuò)配 Mismatch,互變異構(gòu)移位,脫氨基作用 (環(huán)外氨基),堿基丟失 自發(fā)水解,堿基修飾與鏈斷裂,堿基異構(gòu)式引起DNA復(fù)制的錯(cuò)配,錯(cuò)誤配對,正確配對,環(huán)出效應(yīng),其它因素引起DNA損傷,吖啶類化合物: 吖啶橙 扁平染料分子 (不等交換),氧自由基 (加成反應(yīng) 小自由基反應(yīng)),DNA損傷的后果,DNA損傷后分子的最終改變,點(diǎn)突變 ： 轉(zhuǎn)換與顛換,缺失,插入,倒位或轉(zhuǎn)位,DNA斷裂,DNA重排,DNA分子內(nèi)發(fā)生較大片段的交換，可以在同一染色體的兩條鏈間發(fā)生，也可在不同染色體之間發(fā)生，可以是原來的方向或顛倒的方向。,第二節(jié) DNA修復(fù),DNA的修復(fù)主要類型:,直接修復(fù),光裂合酶修復(fù),

4、切除修復(fù),重組修復(fù),跨損傷修復(fù) (SOS修復(fù)),常見的DNA損傷及其修復(fù)機(jī)制,（1）DNA斷裂口直接修復(fù)：,在 DNA 5-P 端和 3-OH端未受損害的情況下，連接酶能夠直接修復(fù)DNA的斷裂口。,（2）DNA紫外線損傷的光復(fù)合酶直接修復(fù),（3） 烷基化堿基的直接修復(fù),在 大腸桿菌中的Ada酶，可修復(fù)甲基化的堿基和甲基化的磷酸二酯鍵。, 堿基切除修復(fù),指切除和替換由內(nèi)源性化學(xué)物作用產(chǎn)生 的DNA堿基損傷, 是切除修復(fù)的一種。 受損堿基移除是由多個(gè)酶來完成的。 主要針對DNA單鏈斷裂和小的堿基改變 及氧化性損傷。,(4) Base Excision Repair,DNA的損傷的切除修復(fù),堿基缺陷

5、或錯(cuò)配, 核苷酸切除修復(fù),體內(nèi)識別 DNA 損傷最多的修復(fù)通路,主要修復(fù)扭曲雙螺旋結(jié)構(gòu)的 DNA 損傷以及阻斷基因轉(zhuǎn)錄和不識別任何特殊的堿基損失，而是識別雙螺旋形狀的改變。,不識別任何特殊的堿基損失，而是識別雙螺旋形狀的改變；修復(fù)時(shí)切除含有損傷堿基的那一段 DNA 。,(5) 核苷酸切除修復(fù) (大腸桿菌),核苷酸切除修復(fù) (基因組修復(fù)人),核苷酸切除修復(fù) (轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù) -人類),GGR 和TCR的共同修復(fù)通路,錯(cuò)配修復(fù),校正活性所漏校的堿基, 使復(fù)制的保真性提高102103倍,錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng) (MRS Mismatch Repair System),DNApol (= 10-8) 經(jīng)第二次校正

6、= 10-11, 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)組成（Mismatch repair system）,DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶),DNA polymerase 填補(bǔ)單鏈 DNA 缺口,Helicase SSB 外切核酸酶 (和) 連接酶,MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mut H, L, S,掃描新生鏈中錯(cuò)配堿基,酶切含錯(cuò)配堿基的DNA區(qū)段,錯(cuò)配修復(fù),錯(cuò)配修復(fù),大腸桿菌 DNA 甲基化位點(diǎn) 新合成的DNA,Mis-paired bases,錯(cuò)配修復(fù),重組修復(fù)機(jī)制,重組修復(fù), DNA于復(fù)制時(shí)會越過受損區(qū)域進(jìn)行復(fù)制, 經(jīng)重組修復(fù)，受損的DNA仍然存在于子

7、代的 一個(gè)細(xì)胞中。, 重組修復(fù)不會浪費(fèi)時(shí)間， 重組修復(fù)可讓負(fù)傷的DNA在細(xì)胞中仍可照常進(jìn)行分裂。,非同源末端連接：DNA分子之間不需要廣泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重組時(shí)對DNA雙鏈進(jìn)行連接，在細(xì)胞有絲分裂G1/G0期起主要作用。,重組修復(fù),根據(jù) DNA 末端連接需要的同源性，分為,同源重組：需要多種蛋白參與；也修復(fù) DNA復(fù)制中的差錯(cuò)；在減數(shù)分裂、細(xì)胞有絲分裂后期S/G2期起主要作用。,(7) SOS 修復(fù),Irradiation of bacteria before virus infection enhanced repair of damaged viral genes but le

8、d to mutations.,UV,UVd T4 phage,E. coli,Few surviving phage,UVd T4 phage,E. coli,Higher frequency of surviving phage, but many mutants.,SOS 修復(fù)誘導(dǎo) DNA 聚合酶活性,LexA (一種DNA結(jié)合抑制蛋白), umuC 和 umuD, 編碼 DNA聚合酶活性,允許復(fù)制跨過 損傷位點(diǎn), 常插入一個(gè)或幾個(gè) A堿基.,AGCTAGTCAT/TCAGTC,AGCTAGTCAT/TCAGTC TCGATCANNNNGTCAG,Replication stops at

9、 T/T dimer,Error-prone polymerase allows replication to proceed, albeit inaccurately,SOS response:,RecA-P的三種功能,當(dāng)DNA復(fù)制受阻/ DNA damaged,當(dāng)DNA復(fù)制度過難關(guān)后,SOS 修復(fù),DNA復(fù)制不很嚴(yán)格，新合成的DNA容易造成錯(cuò)誤產(chǎn)生突變。,線粒體損傷和修復(fù),線粒體的氧化損傷: 單鏈斷裂、雙鏈斷裂、堿基修飾、 DNA交聯(lián)、烷化損傷,線粒體的損傷修復(fù)： 堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù),DNA 修復(fù),維持 DNA序列的保真性； 可在復(fù)制前后進(jìn)行； 有多種修復(fù)機(jī)制來糾正DNA損傷； DNA

10、 修復(fù)失敗可能導(dǎo)致突變和腫瘤。,細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制,真核生物細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)細(xì)胞除了誘導(dǎo)修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄外，還可暫時(shí)阻斷細(xì)胞周期，防止受損DNA繼續(xù)復(fù)制，如無法修復(fù)，則可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡。這些都是細(xì)胞通過細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制（checkpoint control，又稱關(guān)卡控制）對DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)。,酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制機(jī)制,哺乳類動物的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制機(jī)制,第三節(jié) DNA損傷和修復(fù)的生物參考標(biāo)志,一、甲基化損傷修復(fù)相關(guān)基因,甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）把O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上，修復(fù)甲基化的DNA。 MGMT突變可作為甲基化損傷的基因型標(biāo)記物。,二、切除修復(fù)相關(guān)

11、的酶和基因,尿嘧啶糖基化酶為主要的始動因素，可作為DNA損傷的生物標(biāo)記物。 大腸桿菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除修復(fù)基因等,三、錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因,MSH2、MLH1等蛋白參與錯(cuò)配修復(fù)，而錯(cuò)配修復(fù)的缺陷往往是癌變的第一步。 錯(cuò)配修復(fù)基因：Muthls系統(tǒng)、人類的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。 錯(cuò)配修復(fù)基因的微衛(wèi)星序列的不穩(wěn)定性 （microsatellite instability， MI）,四、 DNA聚合酶,DNA聚合酶參與輻射損傷和化學(xué)損傷的修復(fù)，并對細(xì)胞的生長具有調(diào)節(jié)作用。 DNA聚合酶 的突變可導(dǎo)致堿基切除修復(fù)功能的缺陷。,五、 DNA加合物也可作為修

12、復(fù)功能的生物標(biāo)記物,DNA加合物可作為DNA損傷的暴露標(biāo)記物和效應(yīng)標(biāo)記物，其去除的速度也可作為DNA修復(fù)功能的生物標(biāo)記物。,DNA損傷和修復(fù)的生物學(xué)意義,避免基因組的不穩(wěn)定性、癌癥和細(xì)胞死亡是至關(guān)重要的。 DNA修復(fù)途徑可以識別和修復(fù)特異的DNA損傷，保證生物物種的遺傳穩(wěn)定性。,與DNA修復(fù)有關(guān)的人類遺傳疾?。?著色性干皮病(Xeroderma pigmentosum) 布倫氏癥候群(Blooms syndrome) 遺傳性大腸癌(Hereditary nonpolyposis colon cancer；HNPCC),著色性干皮病(Xeroderma pigmentosum),是一種隱性遺傳性

13、疾病，有些呈性聯(lián)遺傳。因核酸內(nèi)切酶異常造成DNA修復(fù)障礙所致。臨床以光暴露部位色素增加和角化及癌變?yōu)樘卣鳌?1. 幼年發(fā)病，常有家族發(fā)病史。 2. 面部等暴露部位出現(xiàn)紅斑、褐色斑點(diǎn)及斑片，伴毛細(xì)血 管擴(kuò)張，間有色素脫失斑和萎縮或疤痕。皮膚干燥。數(shù)年內(nèi)發(fā)生基底細(xì)胞癌、鱗癌及惡性黑素瘤。 3.皮膚和眼對日光敏感。 4.病情隨年齡逐漸加重，多數(shù)患者于20歲前因惡性腫瘤而死亡。 5.組織病理 晚期出現(xiàn)表皮非典型性增生、日光角化及鱗癌和基底細(xì)胞癌等惡性腫瘤。,著色性干皮病患兒臉部特征,著色性干皮病背部,著色性干皮病組織切片,著色性干皮病的并發(fā)癥,著色性干皮病的治療,避免紫外線照射 避免腫瘤致病因子 對癥

14、治療,遺傳性大腸癌的臨床特征,發(fā)病早 (45 歲) 腫瘤好發(fā)部位 腸外腫瘤的類型,遺傳性大腸癌(HNPCC),息肉較少 30-60% 有內(nèi)膜腫瘤 惡性腫瘤好發(fā)部位 胰腺癌發(fā)生率,大腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素 (CRC),0,20,40,60,80,100,General population,Personal history of colorectal neoplasia,Inflammatory bowel disease,HNPCC mutation,FAP,5%,15%20%,15%40%,70%80%,95%,Lifetime risk (%),錯(cuò)配基因的改變,多發(fā)性家族性結(jié)腸癌,多發(fā)性家族性結(jié)腸癌,錯(cuò)配基因的改變 : MSH2, MSH6, PMS1 ， MLH1, MSH3, PMS2.,HNPCC中錯(cuò)配基因突變的概率,MSH2 30%,MLH1 30%,PMS1 (rare),PMS2 (rare),MSH6 (rare),Unknown 30%,Sporadic,Familial,HNPCC,FAP,Rare CRC syndromes,Liu B et al. Nat