1、實驗三重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌,實 驗 目 的,學習將重組質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌的方法 學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法 為下一步重組體篩選做準備,實 驗 原 理,遺傳學中轉(zhuǎn)化的基本含義是使細胞獲得一新的可遺傳的表型性狀。分子克隆中用人工的方法將重組質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌細胞，使攜帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌獲得在抗生素平板上生長的能力，從而與不攜帶重組質(zhì)粒的的細菌區(qū)分開來，這個過程就是轉(zhuǎn)化。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進受體細菌時，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。大腸桿菌細胞經(jīng)過一些特殊方法（電擊法、 CaCl2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許

2、外源DNA分子進入的細胞即感受態(tài)細胞(Competent cells)。,轉(zhuǎn)化(Transformation) 是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。 0.1mol/L CaCl2是一種低滲溶液，在0低溫處理大腸桿菌細胞時，細胞膨脹成球形，DNA可吸附在其表面。在短暫的熱沖擊（如42 ）下，細胞可吸收外源DNA。 為了鑒定這些轉(zhuǎn)化子，須利用質(zhì)粒編碼的篩選標記，這些標記賦予細菌新的表型，是成功轉(zhuǎn)化的細菌很容易被篩選出來。pET32a質(zhì)粒帶有氨芐西林抗性基因（Ampr），其重組體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌能夠在含氨芐西林的培

3、養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的受體菌則不能再這種培養(yǎng)基上生長。,Ampr：氨芐西林抗性基因 內(nèi)酰胺酶,多克隆位點（MCS）：外源DNA片段的插入位點,Amps菌株,Ampr,涂布于含Amp的培養(yǎng)基上，可以生長。次日可見白色菌落- 轉(zhuǎn)化子。,培養(yǎng)基上含有X-Gal和IPTG時，可使用藍白斑篩選方法鑒別真正的重組的轉(zhuǎn)化子。,pET32a,pET32a,結(jié)構(gòu)的三大要素： 多克隆位點 選擇標記（耐藥性，LacZ） 復制起始位點 種類： 質(zhì)粒 噬菌體 酵母人工染色體（YAC） 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 表達載體等,pET-32a Vector,The pET System is the most powerful sys

4、tem yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.,pET-32 cloning/expression region,Vector (pET-32a),Gene fragment (SmPR10),pET32a-SmPR10,材料、設(shè)備及試劑,材料 E. coli DH5菌株: R-、M-、Amp- (轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M),它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。） pET32a-SmP

5、R10質(zhì)粒DNA（濃度：2 ng/l): 實驗室自制 設(shè)備 恒溫搖床；電熱恒溫培養(yǎng)箱；臺式高速離心機；超凈工作臺；低溫冰箱；恒溫水浴鍋；分光光度計；微量移液槍。,試劑 1、LB固體和液體培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基配方：（單位g/L） 胰蛋白胨 10 酵母提取物 5 NaCl 10 瓊脂粉（1.5%） 15g （注：LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉） 按配方稱量藥品,加入一定量的ddH2O后置電爐上加熱熔解瓊脂，待瓊脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。121濕熱高壓滅菌20分鐘，待冷卻至60左右,在超凈工作臺中加入一定量的Amp儲存液,使終濃度為100g/ml,搖勻后用培養(yǎng)

6、皿鋪板。,2、Amp母液： 稱取氨芐西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22m濾器過濾除菌，用1.5ml離心管分裝后儲存于-20冰箱. 3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 稱0.56gCaCl2(無水分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22m濾器過濾除菌或高壓滅菌。EP管分裝于4冰箱儲存 . 4、 pET32a-SmPR10質(zhì)粒：實驗室自制,操 作 步 驟,（一） 受體菌的培養(yǎng) 1、取-70或-20貯存的大腸桿菌DH5菌種，在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，進行活化; 2、取幾微升活化后的菌液（取量視菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；從LB平板上挑

7、取單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。 3、將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600 0.5左右(生長對數(shù)期）。（注：這一步非常關(guān)鍵。培養(yǎng)過度的菌液含有較多的“老”細胞，制備成感受態(tài)細胞后其接受外援DNA能力較低，從而導致轉(zhuǎn)化率降低。）,（二）、 感受態(tài)細胞的制備 ( CaCl2 法) 1、將菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4、4000rpm離心10分鐘。 2、棄去上清,用預冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml輕輕懸浮細胞,冰上放置10分鐘后,4、4000

8、rpm離心10分鐘。 3、棄去上清,加入0.1ml預冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞。每份100l（注意懸液密度要均勻）,冰上放置備用。 4、暫時不用的感受態(tài)細胞可置于 -80保存。,注：CaCl2處理后的細胞比較脆弱，盡量溫柔操作！,（三） 重組質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒和感受態(tài)細胞混和：在100l感受態(tài)細胞懸液中加入5l重組質(zhì)粒DNA（ pET32a-SmPR10 ），輕輕混勻后冰上放置30分鐘。 熱擊：42水浴中熱擊60秒（注：精確計算時間，熱擊過長將對細胞造成傷害）,熱擊后馬上置于冰上冷2-5分鐘。 復蘇：向每管中加入800l LB液體培養(yǎng)基(注：不含Amp),混勻后

9、在37150rpm輕搖培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。,思考：熱擊后的細胞已吸入外源質(zhì)粒，如本實驗中的pET32a，該質(zhì)?？少x予宿主氨芐青霉素抗性。但是為什么復蘇時用的LB培養(yǎng)液不加Amp？,（四）涂布平板篩選轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 將管中培養(yǎng)液搖勻后取100l 均勻涂布于含Amp的篩選平板上。 （注：將培養(yǎng)液搖勻后涂布。） 2. 正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37溫箱中培養(yǎng)過夜，次日觀察實驗結(jié)果。,預期實驗結(jié)果,感受態(tài)細胞+重組質(zhì)粒,0.1MCaCl2+重組質(zhì)粒,感受態(tài)細胞+無菌水,實驗報告,思考題 (1). 根據(jù)本實驗你認為影響

10、轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？(2). 如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？,實驗中要考慮的重要因素,為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素： 1. 細胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次繼代或儲于的培養(yǎng)菌，最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。,2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。10ng的cccDNA即可使100l 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5。 3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是高純度的(GR.或AR.),并用