1、第十五章 免疫細胞功能檢測技術(shù)第一節(jié) 淋巴細胞的功能檢測淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定淋巴細胞 T細胞（負責(zé)細胞免疫功能） B細胞（執(zhí)行體液免疫功能） NK細胞（非特異性免疫作用） 一、T細胞功能的檢測 T細胞增殖試驗 T細胞分泌功能測定 T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗 體內(nèi)試驗（一）T淋巴細胞增殖試驗淋巴細胞DNA合成分化細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松母細胞刺激物1. 原理：未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴

2、細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑m)核大小、染色質(zhì)核仁有 絲 分 裂 胞質(zhì)、著色漿內(nèi)空泡偽足1220增大、疏松 清晰、14個有或無增多、嗜堿有或無有或無1216增大、疏松有或無無增多、嗜堿有或無有或無68不增大、密集無無極少、天青色無無2. 淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：PHA-T細胞ConAT細胞PWM -T、 B細胞LPSB細胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原3. 檢測方法形態(tài)法：刺激物同位素法：PHA淋巴細胞（4-6天）淋巴細胞（54h）母細胞化DNA合成期+3HTdR摻入收集細胞檢測射線測定細胞內(nèi)的3HTdR（1）形態(tài)學(xué)檢查法轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)轉(zhuǎn)化率=100%轉(zhuǎn)

3、化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)方法學(xué)評價： 優(yōu)點：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。 缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。 （2）3H-TdR摻入法培養(yǎng)液PHA3H-TdR淋巴細胞過濾全血離心測量放射性分層液SI = 試驗孔A 570nm均值對照孔A 570nm均值 優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好。 缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。(3) MTT 比色法培養(yǎng)液PHA淋巴細胞過濾全血離心測量測放吸射光性度分層液3H-MTTdTR(二) T細胞分泌功能測定體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗

4、原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學(xué)、細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。（三）T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗 1.原理：致敏CTLT細胞靶細胞抗原靶細胞觀察活力 2.方法意義：腫瘤患者CTL腫瘤細胞的能力 形態(tài)學(xué)方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數(shù)殘留腫瘤細胞圖15-2 T細胞細胞毒試驗示意圖 51Cr釋放法靶細胞51Cr測量上清液中釋放的51Cr效應(yīng)細胞洗滌去除游離的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時 (四) 體內(nèi)試驗 特異性抗原皮膚試驗 PHA皮膚試驗二、B細胞功能檢測 B細胞增殖能力的試驗 溶血空斑試驗 B細胞抗體形成功能的檢測 體內(nèi)試驗(一)B細胞

5、增殖能力的試驗抗IgM細菌脂多糖SAC的SPAB細胞增殖形態(tài)學(xué)3HTdR摻入法 (二) 溶血空斑試驗1. 原理：2. 方法學(xué)： 經(jīng)典溶血空斑形成試驗 被動溶血空斑試驗3臨床應(yīng)用與評價 溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響 評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。(三)B細胞抗體形成功能的檢測酶聯(lián)免疫斑點法1.原理：2應(yīng)用與方法學(xué)評價： 該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。 優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量； 可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。(四)體內(nèi)試驗 體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、

6、多價肺炎鏈球菌菌苗等。 將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細胞的功能。 三、NK細胞活性測定 染色計數(shù) 形態(tài)法 酶釋法 熒光法 同位素法 化學(xué)發(fā)光法靶細胞溶解 測CPM值 測發(fā)光強度常用靶細胞:K562細胞株離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細胞熒光第二節(jié) 吞噬細胞功能檢測技術(shù)按其形態(tài)大小分為兩類：大吞噬細胞單核-吞噬細胞系統(tǒng)小吞噬細胞中性粒細胞吞噬細胞的功能：趨化吞噬胞內(nèi)殺滅作用一、中性粒細胞功能的檢測 細胞趨化功能的檢測 吞噬和殺菌功能的檢測(一) 細胞運動功能趨化功能檢測1.原理：2

7、. 方法學(xué)：濾膜滲透法（Boyden 小室法）瓊脂糖平板法(二)吞噬和殺菌功能測定1顯微鏡檢查法：吞噬細菌的白細胞數(shù)吞噬率(%) =100計數(shù)的白細胞數(shù)胞內(nèi)含著染菌體的細胞數(shù)殺菌率(%) =100計數(shù)的白細胞數(shù)2. 溶菌法殺菌率(%) =（1 - 作用30、60或90 min 菌落數(shù)）1000 min 菌落數(shù)3NBT還原試驗NBT還原試驗原理：N-NH2 CN=NHN-N- CN=N-R-+H+甲chan（紫黑色）四氮唑基（淡黃色）中性粒細胞NBT甲撍顆粒沉積于胞質(zhì)中二、巨噬細胞功能檢測(一)炭粒廓清試驗正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜

8、脈注射墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。(二)吞噬功能檢測巨噬細胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能，常用雞紅細胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細胞。(三)巨噬細胞溶酶體酶的測定1. 酸性磷酸酶的測定硝酸鉛法偶氮法2. 非特異性酯酶的測定常用-萘醋酸法(四) 細胞毒作用測定用IFN-激活小鼠巨噬細胞，觀察其對125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細胞瘤P815的活性。(五) 巨噬細胞促凝血活性測定激活的巨噬細胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加

9、速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37預(yù)溫的正常兔血漿和CaCl2 混合液，加入經(jīng)粘附有單層巨噬細胞的試管中，移置37，即時記錄血漿凝固時間。第三節(jié) 免疫細胞功能檢測的臨床應(yīng)用 反映機體免疫功能狀態(tài)。 腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾病預(yù)后監(jiān)測。 組織器官移植后對受者的細胞免疫學(xué)功能監(jiān)測則有利于排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)，以便及時采取有效措施。思考題T細胞功能檢測內(nèi)容有哪些？什么是T細胞增殖試驗的原理、刺激物及方法學(xué)？何謂T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗的原理和方法學(xué)？ 何謂結(jié)核菌素皮膚試驗？B細胞功能檢測的方法學(xué)有哪些？何謂溶血空斑試驗的原理和方法學(xué)？NK細胞活性測定的方法學(xué)有哪些？中性粒細胞功能檢測方法學(xué)及相應(yīng)原理。巨噬細胞功能檢測方法學(xué)及相應(yīng)原理。1.2.3.4.5.6.7.8.9.10. 免疫細胞功能檢測的臨床應(yīng)用有哪些？重點免疫細胞功能檢測試驗名稱選擇題1. Boyden小室常用于測定（A. 白細胞吞噬功能B. 中性粒細