1英漢縮略語名詞對照英文縮寫 英文全稱 中文全稱ACP5 tartrate-resistantacid phosphatase 5 耐酒石酸酸性磷酸酶 5AFP alpha-fetoprotein 甲胎蛋白Afr1 alpha-fetoprotein regulator 1 甲胎蛋白調(diào)節(jié)因子 1Afr2 alpha-fetoprotein regulator 2 甲胎蛋白調(diào)節(jié)因子 2BME beta-mercaptoethanol -巰基乙醇bp base pair 堿基對BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白Zbtb20 Zinc finger and BTB domain containing 20BTB 鋅指蛋白 20cDNA complementary DNA 互補(bǔ) DNAddH2O double distilled water 雙蒸水DNA deoxyribonucleic acid 脫氧核糖核酸DNase deoxyribonuclease DNA 酶FOXM1 Forkhead box transcription factor M1 轉(zhuǎn)錄因子 FOXM1FBS fetal bovine serum 胎牛血清FQ-PCR fluorescence quantitative PCR 熒光定量 PCRFTF fetoprotein transcription factor 胚胎蛋白轉(zhuǎn)錄因子GFP green fluorescent protein 綠色熒光蛋白HCC hepatocellular carcinoma 肝細(xì)胞肝癌HNF1 hepatocyte nuclear factor 1 肝細(xì)胞核因子 1HRP horseradish peroxidase 辣根過氧化物酶KD kilodalton 千道爾頓M mol/L 摩爾/升MEM Eagles minimum essential medium 最低必需培養(yǎng)液MMPs matrix metalloproteinases 基質(zhì)金屬蛋白酶2MOI multiplicity of infection 感染復(fù)數(shù)mg milligram 毫克ml milliliter 毫升min minute 分鐘mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸NFI nuclear factor I 核因子 Ing nanogram 納克OD optical density 光密度PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS phosphate buffer saline 磷酸鹽緩沖液PCR polymerase chain reaction 聚合酶鏈反應(yīng)pH potential of hydrogen 酸堿度PS Penicillin-Streptomycin 青/鏈霉素Raf Regulator of alpha-fetoprotein 甲胎蛋白調(diào)節(jié)因子RNA ribonucleic acid 核糖核酸RNase ribonuclease RNA 酶s second 秒SDS sodium dodecyl sulfute 十二烷基硫酸鈉Tris tris hydroxymethyl amino methane 三羥甲基氨基甲烷l microlitre 微升M micromol/L 微摩爾/升g microgram 微克VEGF vascular endothelial growth factor 血管內(nèi)皮生長因子Zhx2 Zinc-fingers and homeoboxes 2 鋅指同源框蛋白 2摘 要目的：研究人肝細(xì)胞肝癌（HCC）中轉(zhuǎn)錄因子 FOXM1 表達(dá)的臨床意義及其調(diào)控 AFP 表達(dá)與分泌的分子機(jī)制。3方法：（1）采用 Western blot 技術(shù)檢測 52 例 HCC 患者肝癌組織中FOXM1 蛋白的表達(dá)，并分析其與 HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系；（2）采用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測 HCC 患者肝癌組織中 AFP mRNA 表達(dá)水平，電化學(xué)發(fā)光法檢測患者術(shù)前血清 AFP 分泌水平，通過 Pearson 相關(guān)性分析方法分析 HCC 患者癌組織中 FOXM1 蛋白表達(dá)水平和 AFP mRNA 表達(dá)水平及術(shù)前血清 AFP 分泌水平三者的相關(guān)性；（3）最佳 MOI 的重組 FOXM1 腺病毒分別感染 AFP 高表達(dá)的HepG2、HepG2.2.15 細(xì)胞和 AFP 低表達(dá)的 SMMC7721 細(xì)胞，感染 24 h 后通過熒光定量 PCR 技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi) FOXM1 mRNA 表達(dá)情況，感染 48 h 后通過 Western blot 技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi) FOXM1 蛋白表達(dá)情況及其下游基因 cyclinB1 蛋白表達(dá)變化情況；（4）以最佳 MOI 的重組 FOXM1 腺病毒感染HepG2、HepG2.2.15 和 SMMC7721 細(xì)胞，感染 24 h 后通過熒光定量PCR 檢測 FOXM1 蛋白對 AFP mRNA 表達(dá)的影響，感染 48 h 通過Western blot 和電化學(xué)發(fā)光法觀察 FOXM1 蛋白對 AFP 蛋白的表達(dá)及分泌的影響。結(jié)果：（1）FOXM1 表達(dá)與 HCC 腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P 1=0.039，P 2=0.039） ，而與年齡、性別、肝硬化、HBV 感染狀態(tài)和腫瘤分期無關(guān)。4（2）HCC 患者肝癌組織中 FOXM1 蛋白表達(dá)水平與 AFP mRNA表達(dá)水平及術(shù)前血清 AFP 分泌水平均呈正相關(guān)（r=0.448 ，P=0.001 ； r=0.381，P=0.005） 。 （3）HepG2 和 HepG2.2.15 細(xì)胞中 FOXM1 可顯著促進(jìn) AFP mRNA 和蛋白的表達(dá)及 AFP 的分泌；SMMC7721 細(xì)胞中 FOXM1 僅可促進(jìn) AFP mRNA 的表達(dá)，但不能促進(jìn) AFP 蛋白的表達(dá)和分泌。結(jié)論：（1）人肝細(xì)胞肝癌中 FOXM1 表達(dá)與腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，F(xiàn)OXM1 在 HCC 腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用；（2）人肝細(xì)胞肝癌中 FOXM1 表達(dá)與 AFP 的表達(dá)與分泌密切相關(guān)，F(xiàn)OXM1 可能通過調(diào)節(jié) AFP 的轉(zhuǎn)錄在促進(jìn) AFP 表達(dá)中發(fā)揮重要作用。關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞肝癌；FOXM1；AFP mRNA；Alpha-fetoprotein；5EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF FOXM1 IN HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA AND THE MOLECULAR MECHANISM OF FOXM1-REGULATED AFP EXPRESSIONABSTRACTObjective: To investigate the expression and significance of forkhead box M1 (FOXM1) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and the relationship between FOXM1 and Alpha-fetoprotein (AFP).Methods: (1) FOXM1 protein in 52 HCC tissues were detected by Western blot, and the relationship between FOXM1 and clinical characteristics of HCC was analyzed ;(2) AFP mRNA levels in HCC tissues were validated by FQ-PCR, preoperative serum AFP was detected by electrochemiluminescence method, and the correlations among FOXM1, AFP mRNA and preoperative serum AFP were analyzed by Pearson correlation analysis metheod; (3) HepG2, HepG2.2.15 (AFP high-expressing hepatoma cells) and SMMC7721 (AFP low/no-expressing hepatoma cells) cells were treated with Ad-FOXM1 adenovirus, after which the expression level of FOXM1 mRNA was evaluated by FQ-PCR by 24 h, the progression of cell cycle 6and the expression of FOXM1 protein and cyclinB1 protein was respectively detected by flow cytometry and Western blot by 48 h; (4)HepG2, HepG2.2.15 and SMMC7721 cells were treated with Ad-FOXM1 adenovirus, after which the effects of FOXM1 protein on the expression and secretion of AFP mRNA and protein were analyzed by FQ-PCR, Western blot and electrochemiluminescence method, respectively. Results: (1)Over-expression of FOXM1 was associated with the tumor size and lymphatic metastasis (P1=0.039, P2=0.039), but not age, sex, HBV infection status, cirrhosis and tumor differentiation in HCC.(2) FOXM1 protein expression level was positively correlated with both AFP mRNA and preoprative serum AFP (r=0.448, P=0.001; r=0.381, P=0.005), meanwhile, AFP mRNA in HCC tissues was positively correlated with serum AFP (r=0.542，P=0.00004). (3) FOXM1 could increase the expression of AFP both in mRNA and protein level in HepG2 and HepG2.2.15 cells, concomitant with up-regulated AFP secretions. While on the other hand, FOXM1 could only increase the expression of AFP mRNA in SMMC7721 cells, not the expression and secretion of AFP.Conclusion: (1) Over-expression of FOXM1 in HCC was associated with tumor size and lymphatic metastasis, FOXM1 might be associated with the 7development and metastasis of HCC.(2) The expression of FOXM1 correlates with both in vivo and in vitro AFP production in Human hepatocellular carcinoma, FOXM1 may play an important role in regulating the expression of AFP.Key words: hepatocellular carcinoma; forkhead box M1; AFP mRNA; Alpha-fetoprotein8前 言肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是一種常見的惡性腫瘤，位居全球常見惡性腫瘤的第七位，每年有近 700 000 患者死亡，是造成腫瘤患者死亡的第三大殺手 1。近年來，HCC 的治療措施有了顯著進(jìn)展，如除了傳統(tǒng)的放化療治療方法外，還可使用射頻消融術(shù)（RFA） 、動脈化療栓塞術(shù)(TACE)等局部處理技術(shù)或肝移植術(shù)（LTX ） ，但由于其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，且病程進(jìn)展迅速，明確診斷時(shí)多已處于晚期，使得 HCC 死亡率仍居高不下 2。因此，探討 HCC 發(fā)病的分子機(jī)制并藉此尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于診斷和預(yù)后判斷，對于延長HCC 患者的生存期具有至關(guān)重要的作用。FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子是 FOX 轉(zhuǎn)錄因子（forkhead helix transcription factor）家族成員之一，該家族成員以一個(gè)同源保守性的翼狀 DNA 結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和 DNA 修復(fù)等功能，是關(guān)鍵性的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子 3。研究表明，F(xiàn)OXM1在多種惡性腫瘤中高表達(dá) 4-10。已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，F(xiàn)OXM1 表達(dá)增高與小鼠肝癌形成的易感性有關(guān)，在小鼠肝癌形成中不可或缺 11。相反，敲除肝癌細(xì)胞中FOXM1 基因可抑制肝癌細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞周期停滯并抑制肝癌細(xì)胞的侵襲性，影響肝癌的發(fā)展和結(jié)局 12。由此可見，F(xiàn)OXM1 對肝細(xì)胞肝癌的形成具有重要意義。血清甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP) 是肝細(xì)胞肝癌最常用的的特異性標(biāo)志物，在 HCC 的發(fā)生、發(fā)展、診斷和療效評估中具有重要價(jià)值 13-16。分析 AFP 基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)：AFP 在胎肝中高水平表達(dá)，出生后數(shù)周后表達(dá)大幅降低，但當(dāng)肝細(xì)胞再生或癌變時(shí)，AFP 轉(zhuǎn)錄即被重新激活而分泌產(chǎn)生大量 AFP 17，AFP 再活化在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和 HCC 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。但關(guān)于 AFP 基因在HCC 發(fā)生過程中被再活化的分子機(jī)制仍然是未解之謎，也因此而成為肝癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn) 18。已有研究證實(shí)，F(xiàn)OXM1 和 AFP 在肝臟組織內(nèi)的時(shí)空表達(dá)模式呈現(xiàn)出驚人的消長一致性：即胎兒期均主要由胎兒肝細(xì)胞合成，出生后兩者的合成逐漸停止，9但當(dāng)肝細(xì)胞再生或發(fā)生癌變時(shí)，這兩種蛋白的基因重新被激活，可重新大量表達(dá)19。但是，在肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中 FOXM1 是否能夠調(diào)節(jié) AFP 的再活化，促進(jìn)其表達(dá)與分泌尚不清楚。因此，本課題將首先檢測 FOXM1 在 HCC 肝癌組織中的蛋白表達(dá)水平，分析 FOXM1 與 HCC 臨床病理特征間的相關(guān)性；再通過檢測 HCC 肝癌組織中 AFP mRNA 及術(shù)前血清 AFP 分泌水平，分析肝癌組織中 FOXM1 蛋白表達(dá)水平和AFP mRNA 表達(dá)水平及術(shù)前血清 AFP 分泌水平的相關(guān)性；最后，通過檢測肝癌細(xì)胞株中 FOXM1 的表達(dá)對 AFP 表達(dá)和分泌水平的影響，探討 FOXM1 調(diào)控 AFP表達(dá)及分泌的分子機(jī)制，以了解 FOXM1 在人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的意義。本研究分為三個(gè)部分：（一）肝細(xì)胞肝癌中 FOXM1 表達(dá)的臨床意義以 HCC 患者臨床組織標(biāo)本為研究對象，通過 Western blot 技術(shù)檢測其中FOXM1 蛋白的表達(dá)，分析其與 HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系；（二）重組 FOXM1 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)效果驗(yàn)證構(gòu)建并純化重組 FOXM1 腺病毒（Ad-FOXM1 ）和重組 GFP 腺病毒（Ad-GFP） 。分別用不同 MOI 的 Ad-GFP 感染細(xì)胞株，培養(yǎng) 48 h 后觀察 GFP 熒光蛋白表達(dá)水平，確定最佳 MOI；以最佳 MOI 的 Ad-FOXM1 感染細(xì)胞株，感染 24 h 后采用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi) FOXM1 mRNA 表達(dá)情況，感染 48 h 后采用Western blot 技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi) FOXM1 蛋白及其下游基因 cyclinB1 蛋白表達(dá)變化情況。（三）HCC 中 FOXM1 調(diào)控 AFP 的表達(dá)及分泌的分子機(jī)制研究初探以 HCC 臨床標(biāo)本和人肝癌細(xì)胞株為研究對象，采用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測HCC 患者肝癌組織中 AFP mRNA 表達(dá)水平，電化學(xué)發(fā)光法檢測患者術(shù)前血清AFP 分泌水平，Pearson 相關(guān)性分析方法分析 HCC 患者癌組織中 FOXM1 蛋白和AFP mRNA 表達(dá)水平及術(shù)前血清 AFP 分泌水平三者的相關(guān)性；以最佳 MOI 的重組 FOXM1 腺病毒感染人肝癌細(xì)胞株，感染 24 h 后通過熒光定量 PCR 檢測FOXM1 蛋白對 AFP mRNA 表達(dá)的影響，感染 48 h 通過 Western