閩南師范大學(xué)畢業(yè)論文雙水楊醛乙二胺西佛堿鐵配合物與牛血清白蛋白相互作用模式的研究Research the interactation mode between ferrous - BIS salicylidene ethylenediamine and BSA姓 名： 學(xué) 號： 系 別： 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系 專 業(yè)： 應(yīng)用化學(xué) 年 級： 10級 指導(dǎo)老師： 2014年1月10日I摘要雙水楊醛乙二胺西佛堿和鐵（）-雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）的合成，并對配合物1進(jìn)行紅外表征。用熒光光譜及紫外吸收光譜方法，研究該配合物1與牛白蛋白（BSA）的相互作用。研究表明配合物1對BSA猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅，根據(jù)Stern-Volmer 方程, 計算了配合物1與BSA 間的結(jié)合常數(shù)Kq，用Van.t Hoff方程計算了熱力學(xué)參數(shù)；乙醇和EDTA為探針以及透析法推測了配合物1-BSA復(fù)合物透析過程中生成新的物質(zhì)。關(guān)鍵詞：雙水楊醛乙二胺西佛堿；亞鐵離子；熒光光譜；牛血清白蛋白；EDTAAbstractThe Synthesis of BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base and Fe() - BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base .And the structures of Fe() - BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base were confirmed by infrared. We reseached the interactation with the complexes and BSA by UV and molecular fluorescence analysis .The study shows that the quenching effect on BSA belongs to static quenching.We calculated the binding constant Kq of the complexes and BSA according to the Stern - Volmer equation and calculate the thermodynamic parameters with the Van. T Hoff equation.We used Ethanol and EDTA as probe to speculate the new substances from the dialysis process .Key words: BIS salicylidene ethylenediamine Schiff Base; Fe(); fluorescence spectrum;BSA;EDTA目 錄中文摘要 .I英文摘要 .I前言 .11 實(shí)驗部分 .11.1 儀器與試劑 .11.2 亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物 1）的合成 .11.3 配合物 1 與牛血清白蛋白(BSA)相互作用熒光測定 .21.3.1 配合物 1 與 BSA 相互作用常溫?zé)晒鉁y定 .21.3.2 配合物 1 與 BSA 相互作用變溫?zé)晒鉁y定 .21.3.3 配合物 1 與 BSA 相互作用同步熒光測定 .21.4 配合物 1 與 BSA 相互作用紫外測定 .21.5 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用的影響測定 .21.5.1 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的作用紫外測定 .21.5.2 雙水楊醛乙二胺西佛堿與 BSA 相互作用的熒光測定 .31.5.3 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的作用熒光測定 .31.5.4 Fe(edta)配合物對雙水楊醛乙二胺西佛堿 -BSA 復(fù)合物的作用熒光測定 .31.6 乙醇對配合物 1-BSA 復(fù)合物的作用熒光測定 .31.7 采用透析法對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用結(jié)果的測定 .32 結(jié)果與討論 .42.1 亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物紅外光譜表征 .42.2 配合物 1 與 BSA 相互作用的熒光分析 .42.2.1 配合物 1 與 BSA 相互作用常溫?zé)晒夥治?.42.2.2 配合物 1 與 BSA 相互作用熒光猝滅方式分析 .52.2.3 用靜態(tài)猝滅法對配合物 1 與 BSA 的相互作用進(jìn)行分析 .62.2.4 配合物 1 與 BSA 之間的作用力類型分析 .82.2.5 配合物 1 與 BSA 相互作用同步熒光分析 .82.3 配合物 1 與 BSA 相互作用紫外表征 .92.4 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用的影響的分析 .102.4.1 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用的影響的熒光分析 .102.4.2 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用的影響的紫外分析 .102.5 乙醇對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用的影響的熒光分析 .122.6 配合物 1 與 BSA 相互作用模式圖 .122.7 采用透析法對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用結(jié)果的分析 .132.7.1 配合物 1 與 BSA 作用透析后產(chǎn)物紅外光譜表征 .132.7.2 透析法對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用結(jié)果的分析 .143 結(jié)論 .15參考文獻(xiàn) .16致謝 .181前言 蛋白質(zhì)是生物體的重要組成部分，是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。血清白蛋白常作為一種模型蛋白質(zhì)用于生物醫(yī)用材料研究領(lǐng)域 1 , 2 ，可與許多內(nèi)源及外源性化合物結(jié)合起到存儲與轉(zhuǎn)運(yùn)作用 3 , 4 ，即在體內(nèi)起著酸度保持、金屬離子、氨基酸、脂肪酸、藥物等的貯存、運(yùn)載等重要的作用 5，是基礎(chǔ)科學(xué)研究中最常用的藥物靶蛋白之一 6 。從不同角度研究以白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與具有生物活性小分子之間的相互作用，已成為一個非?；钴S的研究課題 7。牛血清白蛋白( BSA) 肽鏈含有 582 個氨基酸殘基，在 ex = 280 nm 時，BSA 的內(nèi)源熒光主要來源于 19 個酪氨酸和 2 個色氨酸殘基。酪氨酸的熒光主要通過能量轉(zhuǎn)移給色氨酸而發(fā)出，2 個色氨酸分別位于 134 位和 212 位，其發(fā)射峰特征、能量轉(zhuǎn)移及熒光壽命等指標(biāo)可以對蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境提供有效的信息 8, 9。本文利用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了鐵（）雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的機(jī)理；利用透析法以及乙醇、EDTA 為探針推測配合物與BSA相互作用模式。1 實(shí)驗部分1.1 儀器和試劑試劑：牛白蛋白(BSA) （生化試劑） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司水楊醛 （AR） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司乙二胺 （AR） 廣東汕頭市西隴化工廠六水合硫酸亞鐵銨 （AR） 廣東汕頭市西隴化工廠EDTA （AR） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司乙醇 （AR） 西隴化工股份有限公司儀器： LS-55 熒光分光光度計 （美國 PE 公司）UV-2550 紫外分光光度計 （Shimadzu 公司）1.2 亞鐵-雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（1）的合成取乙二胺 5.6mL 和 17mL 水楊醛溶解于 50mL 甲醇中，在冷水浴中攪拌30min，靜置 15min，減壓抽濾，用乙醇洗滌，在常溫下干燥 6h，得亮黃色固體粉末，再取 2.5g 固體用 40mL 乙醇重結(jié)晶、抽濾，在常溫下干燥 4h，得黃色晶體即為雙水楊醛乙二胺西佛堿。取雙水楊醛乙二胺西佛堿 1.000g 溶解于40mL 甲醇中，再加入硫酸亞鐵銨 1.000g，回流 1h，冷卻，過濾，干燥，得淡2粉色固體即為 Fe（）雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物 1） 。1.3 配合物 1 與 BSA 相互作用熒光測定1.3.1 配合物 1 與 BSA 相互作用常溫?zé)晒鉁y定稱取0.048g 配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110 -4mol/L的BSA 溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的配合物1溶液，定容。以=292nm為激發(fā)波長，記錄300450nm范圍的熒光光譜。1.3.2 配合物 1 與 BSA 相互作用變溫?zé)晒鉁y定稱取 0.048g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液，并加入不同體積的配合物 1 溶液，定容。將該系列溶液分別于 25,30,35 和 40下，以 =290nm為激發(fā)波長，記錄300450nm 范圍內(nèi)的熒光光譜。1.3.3 配合物 1 與 BSA 相互作用同步熒光測定稱取0.049g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=7.0）配制溶度為110 -4mol/L的BSA 溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的配合物1溶液，定容。以=292nm為激發(fā)波長，測定 =15nm和 =60nm時的同步熒光光譜。1.4 配合物1與BSA相互作用紫外測定稱取 0.024g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 緩沖溶液（pH=6.9）配制溶度為 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL的容量瓶中加入 1.00mL 的配合物 1 溶液，并加入不同體積的 BSA 溶液，定容。以配合物 1 溶液為參比液，記錄 200500nm 范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。1.5 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用的影響測定1.5.1 EDTA 對配合物 1-BSA 復(fù)合物的作用紫外測定稱取 0.048g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，稱取 0.039gEDTA用 HAc-NaAc 緩沖溶液（ pH=6.8）溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL 的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 3.00mL 配合物 1 溶液，再3加入不同體積的 EDTA 溶液，定容。以配合物 1 與 BSA 混合液為參比液，記錄 200500nm 范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。1.5.2 雙水楊醛乙二胺西佛堿與 BSA 作用的熒光測定稱取0.032g雙水楊醛乙二胺西佛堿溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110 -4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的雙水楊醛乙二胺西佛堿溶液，定容。以=280nm為激發(fā)波長，記錄 300450nm范圍的熒光光譜。1.5.3 EDTA 對配合物 1- BSA 復(fù)合物的相互作用的影響熒光測定稱取 0.048g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，稱取 0.039gEDTA用 HAc-NaAc 緩沖溶液（ pH=6.8）溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL 的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 3.00mL 配合物 1 溶液，再加入不同體積的 EDTA 溶液，定容。以 =280nm為激發(fā)波長，記錄 300450nm范圍的熒光光譜。1.5.4 Fe(edta)配合物對雙水楊醛乙二胺西佛堿 - BSA 復(fù)合物的作用熒光測定稱取 0.032g 雙水楊醛乙二胺西佛堿溶解并定容于 100mL 容量瓶中，稱取0.016g 六水合硫酸亞鐵銨和 0.030gEDTA 配制摩爾比為 2:1 的 Fe(edta)配合物溶液，用 HAc-NaAc 緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL 的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 5.00mL 雙水楊醛乙二胺西佛堿溶液，再加入不同體積的 Fe(edta)配合物溶液，定容。以=280nm為激發(fā)波長，記錄 300450nm 范圍的熒光光譜。1.6 乙醇對配合物 1-BSA 復(fù)合物的作用熒光測定稱取 0.049g 配合物 1 溶解并定容于 100mL 容量瓶中，用 HAc-NaAc 緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為 110-4mol/L 的 BSA 溶液，然后于一系列 10.00mL的容量瓶中加入 1.00mL 的 BSA 溶液和 3.00mL 配合物 1 溶液，再加入不同體積的乙醇溶液，定容。以 =280nm為激發(fā)波長，記錄 300450nm 范圍的熒光光譜。1.7 采用透析法對配合物 1-BSA 復(fù)合物的相互作用影響的測定4稱取 0.050g 配合物 1 和 0.10gBSA，加入 30mL 蒸餾水溶解。用透析袋透析且每隔 2 天換一次水，每次換水前取 1mL 透析袋內(nèi)的原液并稀釋 25 倍，以蒸餾水為參比，記錄 200500nm 范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。2 結(jié)果與討論2.1 亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物紅外光譜表征利用 NicoLet360 光譜儀對亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）進(jìn)行紅外光譜表征，結(jié)果如圖 1 所示。10 20 30 40bav/cm-1圖 1 雙水楊醛乙二胺西佛堿及配合物 1 紅外光譜圖a：雙水楊醛乙二胺西佛堿；b：配合物 1如圖 1 所示，雙水楊醛乙二胺西佛堿（曲線 a）及其配合物 1（曲線 b） 。對比曲線 a 和曲線 b，C-C 振動由 1498cm-1 和 1610 cm-1 移動至 1491 cm-1 和1608 cm-1，變化不明顯，說明水楊醛的基本骨架未變；C-N 伸縮振動由原來的1635 cm-1 移動至 1608 cm-1，向低波數(shù)移動了 27 cm-1，說明 N 原子上的孤對電子可能與 Fe() 發(fā)生配位作用；O-H 在 25003200cm-1 出現(xiàn)寬而散的特征峰移動至 3350cm-1 左右，向高波數(shù)移動，說明 O 原子被 Fe()離子競爭走孤對電子。由此說明，F(xiàn)e() 與雙水楊醛乙二胺西佛堿作用生成新的配合物。2.2 配合物 1 與 BSA 相互作用的熒光表征2.2.1 配合物 1 與 BSA 相互作用常溫?zé)晒夥治龉潭?BSA 的濃度為 110-4mol/L，改變配合物 1 的濃度，并以 ex292 nm5的激發(fā)波長分別激發(fā) BSA 溶液及 BSA 與配合物 1 的混合溶液。然后分別記錄波長為 300450nm 的熒光發(fā)射光譜，其熒光發(fā)射光譜的測定結(jié)果如圖 2 所示。30 350 40 45005010150nmFfedcba圖2 不同濃度配合物1對BSA 溶液熒光光譜的影響af：C 配合物1 /(10-4mol/L )0，1.1，3.3，5.5，7.7，9.9當(dāng)激發(fā)波長為292nm時，配合物1在300450nm范圍內(nèi)無熒光發(fā)射，而BSA由于其本身的色氨酸殘基和絡(luò)氨酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源熒光 10。因此，固定BSA的濃度不變，依次加入不同濃度配合物1，隨著配合物濃度的逐漸增加，BSA在350nm附近的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律的減弱，其結(jié)果如圖 2所示，該特征的出現(xiàn)初步表明配合物1與BSA發(fā)生了一定程度的作用。2.2.2 配合物 1 與 BSA 相互作用熒光猝滅方式分析熒光猝滅是猝滅劑與熒光體激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用的結(jié)果，猝滅過程通常有動態(tài)和靜態(tài)猝滅之分，它們均遵從 Stern-Volmer 方程：F0/F=1+kq0CQ=1+ ksv CQ 式中，F(xiàn) 0 和 F 分別為未加入猝滅劑時 BSA 的相對熒光強(qiáng)度；k q 為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)； 0 為無猝滅劑存在時熒光分子的平均壽命，通常取值 10-8s11；k sv 為 Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，是雙分子猝滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比率；C Q 為猝滅劑的摩爾濃度 12, 13。而區(qū)分動態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅的主要依據(jù)之一是：動態(tài)猝滅主要依賴于分子的擴(kuò)散，增加溫度導(dǎo)致擴(kuò)散速度加快，猝滅常數(shù)將隨著