.,1,基因定位與克隆,.,2,基因定位或基因制圖(gene mapping)： 人類的基因定位或基因制圖(gene mapping)是近年來發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。它的目的在于決定不同的基因在染色體上的位置。一條染色體是一條獨(dú)立的DNA鏈，同一條染色體上的基因在該染色體上呈線性排列。人類的20000-25000個(gè)基因分布在24種染色體上，它們?cè)谌旧w上的位置可通過兩種制圖方法來表示： 1、物理圖譜(physical map)，即確定基因之間的絕對(duì)物理學(xué)距離，通常用Mb(百萬堿基對(duì))或Kb(千堿基對(duì))來表示 2、遺傳圖譜(genetic map)，即確定基因之間的遺傳學(xué)距離，用cM(centimorgen分摩)表示。,廣泛定義,.,3,基因克?。?基因克隆通常涉及到將構(gòu)成某一基因的基因組DNA (genomic DNA，gDNA) 或互補(bǔ)DNA(complemantary DNA, cDNA)插入某一載體內(nèi)，利用載體在宿主細(xì)胞(通常用大腸桿菌)中大量繁殖而獲得該基因的足夠量的拷貝，以便于進(jìn)行基因的結(jié)構(gòu)和功能的分析，廣義的基因克隆也包括任何使基因或DNA片段擴(kuò)增的操作 。,.,4,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)討論的基因定位與克隆實(shí)質(zhì)上不是廣泛意義上的基因定位與克隆，主要針對(duì)致病基因的鑒定，即將某一特定基因的突變與某一特定的疾病聯(lián)系起來，確定基因突變與某一疾病之間的因果關(guān)系，了解其致病機(jī)理，為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。,.,5,基因定位方法strategy for gene mapping,染色體多態(tài)法（chromosome heteromorphism）染色體畸變法(chromosome abnormality)體細(xì)胞雜種法(somatic cell hybrids)染色體分類法(chromosome sorting )原位雜交法（FISH） 劑量分析法(dosage ananlysis)測(cè)序法（sequencing）家系分析法 （pedigree ananlysis）,.,6,染色體多態(tài)法.主要限于性染色體上的定位，根據(jù)某些性狀或疾病在男女性別間的差異，結(jié)合系譜分析，將這些基因定位在X染色體上。Duffy 血型基因定位于1號(hào)染色體上 (Donahue在做染色體實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)自己的1號(hào)染色體長臂在靠近著絲粒區(qū)的地方變長了，通過對(duì)他自己家族成員染色體的觀察發(fā)現(xiàn)，這一異常是遺傳的，將其作為1號(hào)染色體上的一個(gè)特定的標(biāo)記，隨后發(fā)現(xiàn)這一標(biāo)記與Duffy血型具有平行性，表明這種染色體的異常結(jié)構(gòu)同這一基因相連鎖，因此將此血型基因定位于1號(hào)染色體上。),.,7,染色體畸變法畸變常涉及兩個(gè)位點(diǎn)，如果這兩個(gè)位點(diǎn)之一正好是某一功能基因所在的位置，染色體的畸變則肯破壞該基因的正常功能而引起疾病，根據(jù)染色體畸變的位置和疾病發(fā)生的關(guān)系，則可將致病基因定位于染色體的某一特定位置上。,.,8,NLMG,染色體異常進(jìn)行基因定位-睪丸決定因子Testis determining factor,.,9,體細(xì)胞雜種法 體細(xì)胞雜種通常由人和鼠的體細(xì)胞融合而成。這些融合細(xì)胞在最初幾代培養(yǎng)過程中具有選擇性丟失人類染色體趨勢(shì)，而保留所有的鼠染色體。保留在融合細(xì)胞中的染色體可以是多條，也可能只有一條甚至某條染色體的一部分。根據(jù)研究的需要可將含有不同人類染色體的人鼠雜種細(xì)胞組合成人鼠雜種細(xì)胞板(hybrid panel)，結(jié)合雜種細(xì)胞板和PCR的方法或基因劑量分析，或蛋白質(zhì)表達(dá)分析，可將相應(yīng)的基因定位到特定的染色體或染色體片段上，該雜種細(xì)胞板在人類基因定位以及人類基因組計(jì)劃中發(fā)揮過重要的作用。,.,10,體細(xì)胞雜交基因定位示意圖,Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交證明胸苷激酶（TK）位于人的17號(hào)染色體，這是首例應(yīng)用體細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。,.,11,原位雜交法（FISH）如果一個(gè)基因或基因的某一部分已經(jīng)被克隆，則可將該基因用同位素或熒光標(biāo)記和染色體原位的分子雜交，在染色體上恒定出現(xiàn)信號(hào)的區(qū)域即該基因在染色體上的位置。同一染色體上的多個(gè)不同的基因可用不同的熒光標(biāo)記來鑒別他們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置，運(yùn)用這一方法在中期染色體上，可區(qū)分兩個(gè)相隔約2Mb的基因；在間期染色體上，據(jù)稱可鑒別僅相隔50kb的兩個(gè)基因。,.,12,CONNEXIN31.1,.,13,候選克?。焊鶕?jù)基因的功能、結(jié)構(gòu)及已有的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)可能與目的新基因有關(guān)的疾病，然后在相應(yīng)患者中檢測(cè)該基因的突變情況。位置克?。耗壳白畛Ｓ玫姆椒ǎ瑢⒛骋患膊〉闹虏』蛴眠B鎖分析的方法定位在某一染色體的特定位置上或區(qū)域內(nèi)，然后在該位置上或區(qū)域內(nèi)鑒定其致病基因。,.,14,連鎖分析原理,生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生交換，一對(duì)同源染色體上存在著兩兩相鄰的基因座位，若兩者之間距離較遠(yuǎn)，發(fā)生交換的機(jī)會(huì)較多，則出現(xiàn)重組次數(shù)就多；若兩者之間距離較近，則重組機(jī)會(huì)較少。連鎖分析就是根據(jù)基因在染色體上呈線性排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。,.,15,1,2,3,.,16,基因分型,Genotyping,.,17,除性染色體外，每個(gè)人體內(nèi)的染色體都有兩份。一個(gè)人所擁有的一對(duì)等位位點(diǎn)的類型被稱作基因型genotype。 對(duì)SNP位點(diǎn)而言，一個(gè)人有三種可能性，分別是AA，AG或GG 。這種基因型的差異叫做單核苷酸多態(tài)性(SNP)。通過實(shí)驗(yàn)確定某個(gè)個(gè)體在某個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，被稱作基因分型。,.,18,幾種多態(tài)標(biāo)記:（1）RFLPs（2）STRPs（3）SNPs,.,19,第一代標(biāo)記： RFLP（restriction fragment length polymorphism）。 限制性內(nèi)切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改變甚至是一個(gè)堿基的改變，都可能改變限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度，通過凝膠電泳可以方便地檢測(cè)這種長度的“多態(tài)性”。RFLP在整個(gè)基因組中都存在，根據(jù)對(duì)RFLP片段的多態(tài)性分析，可對(duì)某些疾病進(jìn)行診斷并將與疾病有關(guān)的基因進(jìn)行定位。,.,20,/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml,.,21,1980年，Botstein首次提出。使用特殊的外切酶切斷DNA中特殊位點(diǎn) 1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖,包含393個(gè)RFLP位點(diǎn)。缺點(diǎn)：數(shù)目少，信息量??；成本昂貴，操作繁瑣，不易發(fā)展到自動(dòng)化水平。,.,22,第二代標(biāo)記:STR (short tandem repeat polymorphism)。例如基因組中兩個(gè)或兩個(gè)以上的核苷酸短串聯(lián)重復(fù)序列(CA)n，微衛(wèi)星標(biāo)記等，在不同個(gè)體中重復(fù)單位的數(shù)目變異非常大。,.,23,微衛(wèi)星標(biāo)記熒光電泳圖,.,24,STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是2bp-6bp的串聯(lián)重復(fù)，其中以(CA)n ，(GT)n常見。1996年建立了以6000多個(gè)STR為主體的遺傳圖譜，目前有10000個(gè)左右的位點(diǎn)。主要用于個(gè)體識(shí)別優(yōu)點(diǎn)：信息量大；易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。缺點(diǎn)：標(biāo)記數(shù)量不夠多,.,25,隨著人類基因組計(jì)劃、國際人類基因組單體型計(jì)劃（Hapmap計(jì)劃）的完成，大量的SNP被發(fā)現(xiàn)。利用先進(jìn)的高通量基因芯片技術(shù)，精確揭示重大疾病的基因變異，從而闡明疾病的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，是目前科學(xué)界公認(rèn)的最為有效的搜尋重大疾病易感基因的研究方法，被Science雜志評(píng)為2007年十大科學(xué)進(jìn)展之首。,.,26,迄今已發(fā)現(xiàn)的SNP約9001,000萬個(gè)，相關(guān)的文章約4000余篇。特點(diǎn)：數(shù)量豐富雙等位標(biāo)記，簡單的+/-分析根據(jù)結(jié)果可以估算出某個(gè)等位基因在一個(gè)群體中的頻率易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，快速篩查,SNP作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢(shì),.,27,.,28,.,29,.,30,.,31,.,32,.,33,.,34,.,35,家系分析法（Lods）在家系中，重組率是進(jìn)行連鎖分析的基礎(chǔ),.,36,.,37,.,38,.,39,Lod score結(jié)果判定： Lod3肯定連鎖，Lod-2否定連鎖， -2Lod1則還需增加樣本資料。,.,40,2010年在國內(nèi)最早應(yīng)用外顯子組測(cè)序技術(shù)克隆了一個(gè)新的共濟(jì)失調(diào)致病基因TGM6,.,41,.,42,.,43,.,44,2004年定位與克隆角膜環(huán)狀皮樣瘤基因,.,45,角膜環(huán)狀皮樣瘤是一種先天性角膜良性腫瘤，呈常染色體顯性遺傳，以雙側(cè)眼球角膜緣處環(huán)形淡黃色腫塊為特征，可延伸到結(jié)膜，患者可出現(xiàn)視力的改變?nèi)缛跻?、斜視和散光。皮樣瘤由外胚層包括角化的上皮、毛發(fā)、皮脂腺和中胚層包括纖維組織、脂肪組織、血管組成,.,46,.,47,角膜環(huán)狀皮樣瘤家系圖,.,48,基因組掃描的流程,DNA抽提,利用STR引物多重 PCR,Genotype 基因分型,Linkage 連鎖分析,侯選基因，突變檢測(cè),定位基因,.,49,多重PCR,使用PE公司一套覆蓋基因組22條常染色體、高雜合度的微衛(wèi)星位點(diǎn)引物，一共382對(duì)。采用Touchdown程序結(jié)合多重PCR反應(yīng)方法，將512種不同引物混合,放入同一管中進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體積5l,.,50,.,51,.,52,以上結(jié)果說明這個(gè)單體型在該家系中與疾病共分離，而這些重組事件的發(fā)生則將角膜環(huán)狀皮樣瘤疾病基因定位于4q24-26的D4S1572和D4S1522之間15.2 cM范圍內(nèi),.,53,侯選基因的篩選,首先進(jìn)行UCSC數(shù)據(jù)庫（April, 2003）查詢D4S1572-D4S1522之間15.2cM的基因資料 ，結(jié)果顯示在這個(gè)區(qū)間總計(jì)有65個(gè)known genes,52個(gè)Reference genes進(jìn)行候選基因篩選時(shí)，考慮到組織發(fā)生中皮樣瘤為異位到角膜的正常組織，推測(cè)角膜環(huán)狀皮樣瘤致病基因可能與胚層的移行、細(xì)胞的發(fā)育和分化密切相關(guān),.,54,侯選基因的篩選,通過篩選，選取其中3個(gè)能與組織細(xì)胞的發(fā)育分化和移行有關(guān)并在眼睛表達(dá)的基因： CXXC4 PITX2 TM4SF9,.,55,PITX2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與發(fā)育相關(guān)， 有重要的功能,.,56,神經(jīng)性耳聾疾病基因GJB3的克隆,.,57,GJB3基因的計(jì)算機(jī)克隆,.,58,3RACE 或者nested-PCR共獲得cDNA 片段1059bp，其中 ORF 813bp，編碼的氨基酸 270aa個(gè)。該ORF與小鼠Gjb3在813bp的一致性為83.4%，與大鼠Gjb3在813bp的一致性為84.6%。推測(cè)的氨基酸與小鼠Gjb3在270aa 的一致性為82.6%，與大鼠Gjb3在270aa的一致性為83%。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu): 4個(gè)跨膜區(qū) 2個(gè)胞外區(qū) 3 個(gè)胞內(nèi)區(qū),.,59,.,60,1of 5,Human cx31 compare to other GJB protein,.,61,GJB3(connexin 31) was mapped to 1p33-35 by FISH,.,62,定位在1p33-p35的疾病有常染色體顯性遺傳的感覺神經(jīng)性耳聾（DFNA2）、CMT2A型的腓骨肌萎縮癥、變異性紅皮病和眼瞼下垂。我們?cè)谥袊z傳病家系收集數(shù)據(jù)庫收集的神經(jīng)性耳聾和腓骨肌萎縮癥的病人中檢測(cè)突變，在兩個(gè)高頻聽力減退的浙江家系和湖南家系中分別發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義和無義突 變的雜合子，并選擇了非相關(guān)的150名個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，未檢測(cè)到錯(cuò)義和無義突變。,.,63,.,64,.,65,同胞對(duì)連鎖分析,.,67,如果兩個(gè)血緣相關(guān)個(gè)體表型類似，那么與此性狀相關(guān)的基因附近的遺傳標(biāo)記也應(yīng)當(dāng)類似，類似程度受多個(gè)因素的影響:,.,68,.,69,關(guān)聯(lián)研究常見類型,1.病例對(duì)照研究： 收集一組患者以及一組匹配的對(duì)照，比較侯選位點(diǎn)等位基因頻率是否存在顯著性差異 病例對(duì)照研究不需要確認(rèn)家庭單位，容易收集研究對(duì)象，但是其缺點(diǎn)是疾病和位點(diǎn)間的等位基因關(guān)聯(lián)可能因?yàn)槿巳夯旌袭a(chǎn)生，而不是由于遺傳標(biāo)記和染色體上導(dǎo)致性狀的突變位點(diǎn)接近,因此選擇對(duì)照就很必要,.,70,APOE-4,A為實(shí)際觀察值 T為理論期望值,.,71,2.傳遞不平衡檢測(cè)（TDT）： 應(yīng)用家系內(nèi)對(duì)照比較傳遞與未傳遞給受累子代的等位基因頻率有無差異 TDT有效利用未傳遞的等位基因作為對(duì)照,對(duì)照和疾病基因由同一個(gè)體提供，分層就被降低或者消除了,.,72,TDT應(yīng)用前提及特點(diǎn),前提：雜合子父母在研究位點(diǎn)有一個(gè)關(guān)聯(lián)的等位基因和非關(guān)聯(lián)的等位基因，關(guān)聯(lián)的等位基因以非隨機(jī)的高概率傳遞給受累的子代,特點(diǎn)：1.僅僅需要“父母子”三聯(lián)體，家系 容易收集2.比受累同胞對(duì)檢驗(yàn)連鎖的效能