.,1,基因定位與克隆,.,2,基因定位或基因制圖(gene mapping)： 人類的基因定位或基因制圖(gene mapping)是近年來發(fā)展最快的領域之一。它的目的在于決定不同的基因在染色體上的位置。一條染色體是一條獨立的DNA鏈，同一條染色體上的基因在該染色體上呈線性排列。人類的20000-25000個基因分布在24種染色體上，它們在染色體上的位置可通過兩種制圖方法來表示： 1、物理圖譜(physical map)，即確定基因之間的絕對物理學距離，通常用Mb(百萬堿基對)或Kb(千堿基對)來表示 2、遺傳圖譜(genetic map)，即確定基因之間的遺傳學距離，用cM(centimorgen分摩)表示。,廣泛定義,.,3,基因克?。?基因克隆通常涉及到將構成某一基因的基因組DNA (genomic DNA，gDNA) 或互補DNA(complemantary DNA, cDNA)插入某一載體內，利用載體在宿主細胞(通常用大腸桿菌)中大量繁殖而獲得該基因的足夠量的拷貝，以便于進行基因的結構和功能的分析，廣義的基因克隆也包括任何使基因或DNA片段擴增的操作 。,.,4,醫(yī)學遺傳學討論的基因定位與克隆實質上不是廣泛意義上的基因定位與克隆，主要針對致病基因的鑒定，即將某一特定基因的突變與某一特定的疾病聯系起來，確定基因突變與某一疾病之間的因果關系，了解其致病機理，為疾病的診斷、預防和治療提供理論依據。,.,5,基因定位方法strategy for gene mapping,染色體多態(tài)法（chromosome heteromorphism）染色體畸變法(chromosome abnormality)體細胞雜種法(somatic cell hybrids)染色體分類法(chromosome sorting )原位雜交法（FISH） 劑量分析法(dosage ananlysis)測序法（sequencing）家系分析法 （pedigree ananlysis）,.,6,染色體多態(tài)法.主要限于性染色體上的定位，根據某些性狀或疾病在男女性別間的差異，結合系譜分析，將這些基因定位在X染色體上。Duffy 血型基因定位于1號染色體上 (Donahue在做染色體實驗時發(fā)現自己的1號染色體長臂在靠近著絲粒區(qū)的地方變長了，通過對他自己家族成員染色體的觀察發(fā)現，這一異常是遺傳的，將其作為1號染色體上的一個特定的標記，隨后發(fā)現這一標記與Duffy血型具有平行性，表明這種染色體的異常結構同這一基因相連鎖，因此將此血型基因定位于1號染色體上。),.,7,染色體畸變法畸變常涉及兩個位點，如果這兩個位點之一正好是某一功能基因所在的位置，染色體的畸變則肯破壞該基因的正常功能而引起疾病，根據染色體畸變的位置和疾病發(fā)生的關系，則可將致病基因定位于染色體的某一特定位置上。,.,8,NLMG,染色體異常進行基因定位-睪丸決定因子Testis determining factor,.,9,體細胞雜種法 體細胞雜種通常由人和鼠的體細胞融合而成。這些融合細胞在最初幾代培養(yǎng)過程中具有選擇性丟失人類染色體趨勢，而保留所有的鼠染色體。保留在融合細胞中的染色體可以是多條，也可能只有一條甚至某條染色體的一部分。根據研究的需要可將含有不同人類染色體的人鼠雜種細胞組合成人鼠雜種細胞板(hybrid panel)，結合雜種細胞板和PCR的方法或基因劑量分析，或蛋白質表達分析，可將相應的基因定位到特定的染色體或染色體片段上，該雜種細胞板在人類基因定位以及人類基因組計劃中發(fā)揮過重要的作用。,.,10,體細胞雜交基因定位示意圖,Miller等運用體細胞雜交證明胸苷激酶（TK）位于人的17號染色體，這是首例應用體細胞雜交法進行的基因定位。,.,11,原位雜交法（FISH）如果一個基因或基因的某一部分已經被克隆，則可將該基因用同位素或熒光標記和染色體原位的分子雜交，在染色體上恒定出現信號的區(qū)域即該基因在染色體上的位置。同一染色體上的多個不同的基因可用不同的熒光標記來鑒別他們在染色體上的相對位置，運用這一方法在中期染色體上，可區(qū)分兩個相隔約2Mb的基因；在間期染色體上，據稱可鑒別僅相隔50kb的兩個基因。,.,12,CONNEXIN31.1,.,13,候選克?。焊鶕虻墓δ堋⒔Y構及已有的研究發(fā)現，預測可能與目的新基因有關的疾病，然后在相應患者中檢測該基因的突變情況。位置克隆：目前最常用的方法，將某一疾病的致病基因用連鎖分析的方法定位在某一染色體的特定位置上或區(qū)域內，然后在該位置上或區(qū)域內鑒定其致病基因。,.,14,連鎖分析原理,生殖細胞在減數分裂時發(fā)生交換，一對同源染色體上存在著兩兩相鄰的基因座位，若兩者之間距離較遠，發(fā)生交換的機會較多，則出現重組次數就多；若兩者之間距離較近，則重組機會較少。連鎖分析就是根據基因在染色體上呈線性排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標記相連鎖的特點進行定位。,.,15,1,2,3,.,16,基因分型,Genotyping,.,17,除性染色體外，每個人體內的染色體都有兩份。一個人所擁有的一對等位位點的類型被稱作基因型genotype。 對SNP位點而言，一個人有三種可能性，分別是AA，AG或GG 。這種基因型的差異叫做單核苷酸多態(tài)性(SNP)。通過實驗確定某個個體在某個多態(tài)性位點的基因型，被稱作基因分型。,.,18,幾種多態(tài)標記:（1）RFLPs（2）STRPs（3）SNPs,.,19,第一代標記： RFLP（restriction fragment length polymorphism）。 限制性內切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改變甚至是一個堿基的改變，都可能改變限制性內切酶酶切片段的長度，通過凝膠電泳可以方便地檢測這種長度的“多態(tài)性”。RFLP在整個基因組中都存在，根據對RFLP片段的多態(tài)性分析，可對某些疾病進行診斷并將與疾病有關的基因進行定位。,.,20,/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml,.,21,1980年，Botstein首次提出。使用特殊的外切酶切斷DNA中特殊位點 1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖,包含393個RFLP位點。缺點：數目少，信息量?。怀杀景嘿F，操作繁瑣，不易發(fā)展到自動化水平。,.,22,第二代標記:STR (short tandem repeat polymorphism)。例如基因組中兩個或兩個以上的核苷酸短串聯重復序列(CA)n，微衛(wèi)星標記等，在不同個體中重復單位的數目變異非常大。,.,23,微衛(wèi)星標記熒光電泳圖,.,24,STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是2bp-6bp的串聯重復，其中以(CA)n ，(GT)n常見。1996年建立了以6000多個STR為主體的遺傳圖譜，目前有10000個左右的位點。主要用于個體識別優(yōu)點：信息量大；易實現自動化。缺點：標記數量不夠多,.,25,隨著人類基因組計劃、國際人類基因組單體型計劃（Hapmap計劃）的完成，大量的SNP被發(fā)現。利用先進的高通量基因芯片技術，精確揭示重大疾病的基因變異，從而闡明疾病的遺傳學發(fā)病機制，是目前科學界公認的最為有效的搜尋重大疾病易感基因的研究方法，被Science雜志評為2007年十大科學進展之首。,.,26,迄今已發(fā)現的SNP約9001,000萬個，相關的文章約4000余篇。特點：數量豐富雙等位標記，簡單的+/-分析根據結果可以估算出某個等位基因在一個群體中的頻率易于實現自動化，快速篩查,SNP作為遺傳標記的優(yōu)勢,.,27,.,28,.,29,.,30,.,31,.,32,.,33,.,34,.,35,家系分析法（Lods）在家系中，重組率是進行連鎖分析的基礎,.,36,.,37,.,38,.,39,Lod score結果判定： Lod3肯定連鎖，Lod-2否定連鎖， -2Lod1則還需增加樣本資料。,.,40,2010年在國內最早應用外顯子組測序技術克隆了一個新的共濟失調致病基因TGM6,.,41,.,42,.,43,.,44,2004年定位與克隆角膜環(huán)狀皮樣瘤基因,.,45,角膜環(huán)狀皮樣瘤是一種先天性角膜良性腫瘤，呈常染色體顯性遺傳，以雙側眼球角膜緣處環(huán)形淡黃色腫塊為特征，可延伸到結膜，患者可出現視力的改變如弱視、斜視和散光。皮樣瘤由外胚層包括角化的上皮、毛發(fā)、皮脂腺和中胚層包括纖維組織、脂肪組織、血管組成,.,46,.,47,角膜環(huán)狀皮樣瘤家系圖,.,48,基因組掃描的流程,DNA抽提,利用STR引物多重 PCR,Genotype 基因分型,Linkage 連鎖分析,侯選基因，突變檢測,定位基因,.,49,多重PCR,使用PE公司一套覆蓋基因組22條常染色體、高雜合度的微衛(wèi)星位點引物，一共382對。采用Touchdown程序結合多重PCR反應方法，將512種不同引物混合,放入同一管中進行擴增，總反應體積5l,.,50,.,51,.,52,以上結果說明這個單體型在該家系中與疾病共分離，而這些重組事件的發(fā)生則將角膜環(huán)狀皮樣瘤疾病基因定位于4q24-26的D4S1572和D4S1522之間15.2 cM范圍內,.,53,侯選基因的篩選,首先進行UCSC數據庫（April, 2003）查詢D4S1572-D4S1522之間15.2cM的基因資料 ，結果顯示在這個區(qū)間總計有65個known genes,52個Reference genes進行候選基因篩選時，考慮到組織發(fā)生中皮樣瘤為異位到角膜的正常組織，推測角膜環(huán)狀皮樣瘤致病基因可能與胚層的移行、細胞的發(fā)育和分化密切相關,.,54,侯選基因的篩選,通過篩選，選取其中3個能與組織細胞的發(fā)育分化和移行有關并在眼睛表達的基因： CXXC4 PITX2 TM4SF9,.,55,PITX2是一個轉錄調控因子，與發(fā)育相關， 有重要的功能,.,56,神經性耳聾疾病基因GJB3的克隆,.,57,GJB3基因的計算機克隆,.,58,3RACE 或者nested-PCR共獲得cDNA 片段1059bp，其中 ORF 813bp，編碼的氨基酸 270aa個。該ORF與小鼠Gjb3在813bp的一致性為83.4%，與大鼠Gjb3在813bp的一致性為84.6%。推測的氨基酸與小鼠Gjb3在270aa 的一致性為82.6%，與大鼠Gjb3在270aa的一致性為83%。蛋白質的結構: 4個跨膜區(qū) 2個胞外區(qū) 3 個胞內區(qū),.,59,.,60,1of 5,Human cx31 compare to other GJB protein,.,61,GJB3(connexin 31) was mapped to 1p33-35 by FISH,.,62,定位在1p33-p35的疾病有常染色體顯性遺傳的感覺神經性耳聾（DFNA2）、CMT2A型的腓骨肌萎縮癥、變異性紅皮病和眼瞼下垂。我們在中國遺傳病家系收集數據庫收集的神經性耳聾和腓骨肌萎縮癥的病人中檢測突變，在兩個高頻聽力減退的浙江家系和湖南家系中分別發(fā)現錯義和無義突 變的雜合子，并選擇了非相關的150名個體進行檢測，未檢測到錯義和無義突變。,.,63,.,64,.,65,同胞對連鎖分析,.,67,如果兩個血緣相關個體表型類似，那么與此性狀相關的基因附近的遺傳標記也應當類似，類似程度受多個因素的影響:,.,68,.,69,關聯研究常見類型,1.病例對照研究： 收集一組患者以及一組匹配的對照，比較侯選位點等位基因頻率是否存在顯著性差異 病例對照研究不需要確認家庭單位，容易收集研究對象，但是其缺點是疾病和位點間的等位基因關聯可能因為人群混合產生，而不是由于遺傳標記和染色體上導致性狀的突變位點接近,因此選擇對照就很必要,.,70,APOE-4,A為實際觀察值 T為理論期望值,.,71,2.傳遞不平衡檢測（TDT）： 應用家系內對照比較傳遞與未傳遞給受累子代的等位基因頻率有無差異 TDT有效利用未傳遞的等位基因作為對照,對照和疾病基因由同一個體提供，分層就被降低或者消除了,.,72,TDT應用前提及特點,前提：雜合子父母在研究位點有一個關聯的等位基因和非關聯的等位基因，關聯的等位基因以非隨機的高概率傳遞給受累的子代,特點：1.僅僅需要“父母子”三聯體，家系 容易收集2.比受累同胞對檢驗連鎖的效能