桃葉珊瑚苷提取及對細(xì)胞氧化損傷保護作用韓震 李光坤宿州學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院摘要 本研究主要利用色譜的方法，對車前草中桃葉珊瑚苷進行了提取，并進一步測定其對氧化損傷的PC12細(xì)胞的保護作用。經(jīng)過一系列的提取和分離，薄層色譜檢測，最終獲得白色無定形的桃葉珊瑚苷300 mg。利用過氧化氫建立直接的氧化損傷PC12細(xì)胞凋亡模型，利用MTT法檢驗評價桃葉珊瑚苷對細(xì)胞的保護效應(yīng)。結(jié)果表明，桃葉珊瑚苷增強了細(xì)胞活力并且能夠很好的抑制H2O2對PC12細(xì)胞的毒性。關(guān)鍵詞 桃葉珊瑚苷；色譜分析；氧化損傷中圖分類號： 文獻標(biāo)識碼： 文章編號：1 引言桃葉珊瑚苷是一種廣泛存在于自然界許多植物種屬中的環(huán)烯醚萜類化合物，具有通便、護肝、抗微生物、止痛、抗腫瘤、抗炎、抗凋亡等多種生物學(xué)活性1-4。其分子量為346.33，味苦，易溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿、乙醚、石油醚等溶劑中。自發(fā)現(xiàn)天然植物種屬中存在有桃葉珊瑚苷以來，相繼在車前草科（Garryaceae）、玄參科（Scrophulariaceae）、球花科（Globulariaceae）、杜仲科（Eucommiaceae）等植物種屬中發(fā)現(xiàn)了此化合物，其中以車前草和杜仲中的含量很高。桃葉珊瑚苷的主要來源為天然植物中提取，也有人利用組培的方法從杜仲的愈傷組織培提取桃葉珊瑚苷。近年來，由于桃葉珊瑚苷具有分子量小、水溶性高，易于透過血-腦屏障等優(yōu)點，被廣泛的應(yīng)用于腦神經(jīng)元細(xì)胞損傷保護的研究5，大量的研究結(jié)果表明，其保護氧化損傷的作用機制可能是通過保護細(xì)胞免受氧化損傷來實現(xiàn)的。因此，本研究采用色譜聯(lián)合大孔吸附樹脂和柱層析等方法從車前草中分離提出桃葉珊瑚苷，并進一步進行其對細(xì)胞活性保護作用研究，為其應(yīng)用臨床研究奠定前期理論基礎(chǔ)。2 實驗部分2.1 材料與儀器Millipore simplicity-185超純水器（美國密理博公司）；BP211D型電子天平（sartorius）；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；MAXI DRY-LYO冷凍干燥系統(tǒng)（丹麥Heto-Holten公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。大孔樹脂(天津農(nóng)藥股份有限公司樹脂公司）；柱層析用硅膠(青島海洋化工廠)；車前草藥材(宿州市中藥材批發(fā)公司)；桃葉珊瑚苷對照品(純度 99%，美國Sigma公司)和MTT（3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylterazolium bromide）(美國Sigma公司)；其他試劑均為分析純。2.2 實驗方法2.2.1 提取車前草5.0 kg，粉碎機粉碎，用10倍體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇浸泡過夜，超聲提取3次，每次30 min，將提取液合并，低溫真空回收，置水浴鍋上濃縮，離心后取上清液，注入預(yù)處理過的大孔吸附樹脂，蒸餾水洗去糖等雜質(zhì)，用體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液洗脫，250 mL為一個餾分收集洗脫液，薄層色譜檢測，收集合并含目標(biāo)點的餾分。餾分減壓濃縮，將濃縮物進行硅膠柱層析，收集合并含目標(biāo)點的餾分，減壓濃縮，如此重復(fù)硅膠柱層析，得到層析液，收集、冷凍干燥，最后得到白色無定形粉末300 mg。2.2.2 樣品檢測將上述方法得到的粉末進行薄層層析色譜檢測，準(zhǔn)確稱取桃葉珊瑚苷標(biāo)準(zhǔn)品0.7 mg，利用95%的乙醇溶液，將其配成濃度梯度分別為14 mg/ml、7 mg/ml和3.5 mg/ml，分別記著A、B、C。同樣量取95%的乙醇溶液將樣品提取物溶解，配制成濃度為10 mg/ml的樣品溶液，標(biāo)記為D。利用毛細(xì)吸管依此將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液點在硅膠板上，每個濃度溶液點樣30次，并做好記號。利用展開劑（展開劑成分按體積比配制，氯仿：甲醇：石油醚：乙酸乙酯=2：2：1：4）展開，展開結(jié)束后將硅膠板烘干，然后將顯色劑萘酚-硫酸溶液噴上硅膠板，再將其烘干顯色，拍照。2.2.3 桃葉珊瑚苷對PC12細(xì)胞毒性檢測取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，按2104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，在37、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)12 h后用于實驗。桃葉珊瑚苷溶于細(xì)胞培養(yǎng)基中做為母液，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液后加入培養(yǎng)板中，空白對照組加入相同體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后，按規(guī)定的時間培養(yǎng)后加入MTT。培養(yǎng)板在37在培養(yǎng)3 h后，MTT連同培養(yǎng)介質(zhì)被移去，每孔中加入200 l二甲基亞砜溶解藍紫色結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸收度，計算細(xì)胞活力。2.2.4 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷模型構(gòu)建6以2104個細(xì)胞數(shù)量接種在96孔板中。12 h后，分別加入不同濃度的H2O2。用MTT法檢測細(xì)胞活力，每個處理4個平行樣，所有實驗做三次重復(fù)。2.2.5桃葉珊瑚苷抑制H2O2對PC12細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力檢測將不同濃度的配制的桃葉珊瑚苷樣品分別加入到培養(yǎng)介質(zhì)中，同時加入確定好濃度的H2O2，培養(yǎng)一定時間后，MTT法檢測細(xì)胞活力。具體操作方法同上，每個處理4個平行樣，所有實驗做三次重復(fù)。2.2.6 數(shù)據(jù)處理根據(jù)各組檢測結(jié)果計算均值，所有實驗數(shù)據(jù)用平均值 Mean S.D（n=4）表示。3 結(jié)果與討論3.1 薄層層析法檢測桃葉珊瑚苷如圖1所示，A、B、C分別為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品桃葉珊瑚苷溶液，D為檢測樣品，通過此圖可以看出四個樣品點在同一條線上，并且標(biāo)準(zhǔn)品隨著樣品濃度的增加，其點的顏色加深。檢測樣品的顏色和7 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品的濃度相當(dāng)，而且在其他部位沒有出現(xiàn)斑點，由此我們可以確定提取的樣品為高純度的桃葉珊瑚苷。圖1 薄層層析法檢測桃葉珊瑚苷3.2 桃葉珊瑚苷的細(xì)胞毒性檢測桃葉珊瑚苷與培養(yǎng)的PC12細(xì)胞共同孵育348 h后，在濃度為0、10、20、40和100 mg/ml時，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，用MTT檢測細(xì)胞活力表明與對照組相比，也沒有顯著性差異，說明提取物的桃葉珊瑚苷對PC12細(xì)胞沒有毒性作用（如圖2）。圖2 提取物桃葉珊瑚苷的細(xì)胞毒檢測（單位：mg/ml）3.3 H2O2引起PC12細(xì)胞損傷的時間和劑量關(guān)系本實驗采用本實驗室前期實驗的方法，并且獲得了和前期結(jié)果相一致的檢測結(jié)果，見圖3所示。在細(xì)胞接種為2104個數(shù)量下，最終本實驗確定本實驗的H2O2的給藥濃度為0.25 mM。因為，在此濃度下細(xì)胞的活性按照緩慢的梯度下降，在細(xì)胞給藥24 h后，細(xì)胞的活力為對照組的70%左右，而不是急劇壞死，為藥物治療提供了有效的時間窗。圖3 H2O2對PC12細(xì)胞的損傷劑量篩選（單位：mM）*P 0.05, *P 0.01, *P 0.001與對照組相比3.4 桃葉珊瑚苷抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡細(xì)胞活力檢測通過MTT法測定不同濃度桃葉珊瑚苷（0-100 mg/ml）作用3-24 h后，對H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的研究。結(jié)果顯示，提取物桃葉珊瑚苷對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用。在同一時間段，隨樣品桃葉珊瑚苷作用濃度的增加，對細(xì)胞損傷的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性關(guān)系。在濃度為40和100 mg/ml兩個濃度下，桃葉珊瑚苷分別作用12和24 h，和H2O2誘導(dǎo)組相比具有顯著性差異，如圖4所示。圖4 提取物桃葉珊瑚苷對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用（單位：h）*P 0.05, *P 0.01, *P 0.001與對照組相比；#P 0.05, #P 0.01, 與H2O2誘導(dǎo)組相比4 討論桃葉珊瑚苷是存在于車前草中的天然活性成份之一，本提取方法可用于桃葉珊瑚苷的大量制備，此方法也為制備其它環(huán)烯醚萜苷類化合物提供了技術(shù)參考。薄層色譜檢測結(jié)果表明，斑點單一，并且去標(biāo)準(zhǔn)品在同一水平線上。斑點顏色深度和7 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品顏色相當(dāng)，甚至比其濃度更高，說明獲得產(chǎn)品具有很高的純度。H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一種非常廣泛應(yīng)用的檢測藥物治療氧化損傷效果的模型7。在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上初步確定了H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的作用濃度為0.25 mM。另外，本研究進一步利用MTT檢測方法，檢測了桃葉珊瑚苷對PC12細(xì)胞損傷的保護效果，結(jié)果表明桃葉珊瑚苷能夠有效抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞損傷。本實驗也法檢測了提取物桃葉珊瑚苷本身的藥物毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在100 mg/ml濃度以下桃葉珊瑚苷對PC12細(xì)胞不具有毒性作用。綜上所述，從車前草中獲得大量桃葉珊瑚苷是有效可行的，并且提取物具有良好的細(xì)胞活性，為其進一步實驗研究甚至進入臨床應(yīng)用提供了前期基礎(chǔ)。參考文獻1 Ismailoglu U B, Saracoglu I, Harput U S, et al. Effects of phenylpropanoid and iridoid glycosides on free radical-induced impairment of endothelium-dependent relaxation in rat aortic rings J. J Ethnopharmacol, 2002, 79: 193-197.2 Wang Z, An L J, Duan Y L, et al. Catalpol protects rat pheochromocytoma cells against oxygen and glucose deprivation-induced injury J. Neurol Res, 2008, 30 (1): 106-112.3 Li D Q, Bao Y M, Li Y, et al. Catalpol modulates the expressions of Bcl-2 and Bax and attenuates apoptosis in gerbils after ischemic injury J. Brain Res, 2006, 1115 (1): 179-185.4 Jiang B, Du J, Liu J H, et al. Catalpol attenuates the neurotoxicity induced by beta-amyloid (1-42) in cortical neuron-glia cultures J. Brain Res, 2008, 1188: 139-147.5 Xue H Y, Lu Y N, Fang X M, et al. Neuroprotective properties of aucubin in diabetic rats and diabetic encephalopathy rats J. Molecular Biology Reports, 2012, 39: 93119318.6 薛宏宇，李曉宇，李衛(wèi)東等. 凋亡通路蛋白表達對過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響J. 宿州學(xué)院學(xué)報，2011，26 (2): 40-42, 43.7 Jiang B, Liu J H, Bao Y M, et al. Catalpol Inhibits Apoptosis in Hydrogen Peroxide-Induced PC12 Cells by Preventing Cytochrome c Release and Inactivating of Caspase Cascade J. Toxicon, 2004, 43: 53-59.The Extraction of Aucubin and the Protective Effects of Aucubin in the Oxidative Cell DamageHAN Zhen LI Guang-KunDepartment of Chemistry and Life Science, Suzhou UniversityAbstract Through bioassay-guided fractionation way, the aucubin was isolated from plantain, and the protective effect of aucubin on oxidative cell damage was studied by using a rat pheochromocytoma (PC12) cell line. Through a series of extraction and separation, the aucubin obtained from plantain was determintecl by thin layer chromatography (TLC). It is an amorphous white powder and the weight of it is 300 mg. We established the indirect oxidative stress model by using H2O2-induced PC12 cells and further investigated the neuroprotectiv