,1,血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳,【目的要求】 1、掌握電泳技術(shù)的一般原理和基本操作過程。 2、熟悉血清中蛋白分類以及電泳分離操作。,2,【實驗原理】,1.電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。 在一定pH條件下，不同的蛋白質(zhì)由于具有不同的等電點而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同。,3,電場的推動力(F) F=EQ,摩擦阻力(F) F=6rV,V=EQ/(6r),4,【實驗原理】,2. 影響電泳遷移率的因素： 內(nèi)在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀 外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象,5,3.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120m，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點,6,4. 經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。,7,【實驗器材】,1. DYY-6C型 雙穩(wěn)定時電泳儀和DYY-型電泳槽，均為北京市六一儀器廠生產(chǎn) 2.醋酸纖維薄膜（2 cm8cm）：1片/人。 3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.點樣器：載玻片。 5.濾紙：公用。 6.鑷子：一個/組。,8,【實驗試劑】,1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07 mol/L，離子強度0.06)：稱取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥鈉（AR），置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定溶至1000ml。置4保存，備用。 2、0.5% 氨基黑10B染色液：稱取0.5g 氨基黑10B，加蒸餾水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸(AR)10ml，混勻溶解后置具塞試劑瓶內(nèi)貯存。 3、漂洗液：取95% 乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸餾水50ml， 混勻置塞試劑瓶內(nèi)貯存。,9,1.浸泡：將28 cm醋酸纖維薄膜置于電泳緩沖液中，浸泡15 min左右，至完全浸透，方可用于點樣。 2.點樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，迎光判斷光面與無光澤面。用邊緣整齊的玻片沾取少量無溶血血清，垂直按壓于醋纖膜標(biāo)號一端約1.5-2處(約23l)；,【實驗操作】,10,3.電 泳 將點樣端的薄膜平貼在陰極濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極濾紙橋上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。 平衡片刻；使其自然充滿緩沖液；而后電壓120V，電流0.40.6mA/，通電45分鐘。,11,12,4.染色： 電泳完畢后將薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5 min 5.漂洗： 將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍色脫去，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 。 6. 記錄和分析實驗結(jié)果 漂洗完畢后將薄膜取出, 放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在預(yù)習(xí)本上，并判斷分析其結(jié)果。,13,【注意事項】,1、薄膜的浸潤與選擇正確膜面是電泳成敗的關(guān)鍵之一。 2、點樣前，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。 3. 手盡量不要觸及薄膜，用鑷子夾取。 4、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜 片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。垂直點樣。 5、點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。 6、電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。 7、應(yīng)控制染色時間。時間長，薄