細(xì)胞化學(xué)成分顯示,酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)的顯示 DNA、RNA的顯示,實驗?zāi)康模?1.了解細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)基本原理 2.了解細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白和堿性蛋白、DNA和RNA分布狀況 3.熟練血涂片技術(shù),實驗準(zhǔn)備,1、材料 蟾蜍 洋蔥 2、儀器和器材 光學(xué)顯微鏡 解剖器械 載玻片 染色缸 水浴箱 3、試劑 70%乙醇 5%三氯醋酸 0.1%堿性固綠染液 0.1%酸性固綠染液 丙酮 甲基綠-哌羅寧染液,實驗內(nèi)容： 細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白、堿性蛋白的顯示 細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA分布,蟾蜍紅細(xì)胞,洋蔥表皮細(xì)胞,原理： 細(xì)胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)分子中所帶的堿性基團(tuán)(-NH2)和酸性基團(tuán)(-COOH)的數(shù)量不同，在不同PH溶液中，整個蛋白質(zhì)所帶靜電荷多少也不同。 在一定生理條件下： 整個蛋白質(zhì)所帶的負(fù)電荷多（-COO-），就為酸性蛋白；其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。 整個蛋白質(zhì)所帶的正電荷多（NH3+），就為堿性蛋白，其主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。 標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理抽提掉核酸后，用不同pH值的固綠染液分別染色，使細(xì)胞內(nèi)的堿性蛋白與酸性蛋白質(zhì)顯示出來。,一、酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)的顯示,步驟： 處死蟾蜍，制作三張蟾蜍血涂片，晾干。 兩張 70%乙醇固定6min 90、5%三氯醋酸、15min 沖洗 一張酸性固綠5-10min、另一張堿性固綠30-40min 沖洗晾干、觀察 酸性蛋白：細(xì)胞質(zhì)、核仁區(qū)域內(nèi)的蛋白 堿性蛋白：細(xì)胞核內(nèi)組蛋白,處死蟾蜍的方法： 左手握住蟾蜍的身體和四肢，使其腹部貼著掌心，食指壓住蟾蜍頭部前端使其盡量腹屈。在頭與軀干之間可觸及一凹陷(即枕骨大孔所在處)，右手持解剖針直插入此凹陷約2 mm，將針尖轉(zhuǎn)向頭側(cè)插入顱腔搗毀腦組織。將解剖針向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。直至其四肢伸直、肌肉松馳為止。,將推片自血滴左 側(cè)向右移動,將推片自血滴左 側(cè)向右移動,當(dāng)血滴均勻地附著在兩片之間后，再將推 片向左平穩(wěn)地推移,二.細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA分布 原理： 核酸是呈酸性，與堿性染料甲基綠-哌羅寧是具有親和力，這兩種堿性染料有選擇的特異染色，甲基綠把DNA染成綠色，哌羅寧把RNA染成紅色。,步驟： 血涂片，70%乙醇固定6min 晾干 甲基綠-派羅寧滴染20min 沖洗，吸干 丙酮分色（沾2-3次）晾干觀察 一小塊洋蔥表皮 甲基綠-哌羅寧滴染30-40min 滴水沖洗 蓋片、觀察 蟾蜍血涂片：細(xì)胞質(zhì)紅色、核藍(lán)綠色、核仁紫紅 洋 蔥 表 皮：細(xì)胞質(zhì)紅色、核綠色,處死蟾蜍，制作三張蟾蜍血涂片，晾干。 兩張 70%乙醇固定6min 90、5%三氯醋酸、15min 沖洗 一張酸性固綠5-10min、另一張堿性固綠30-40min 沖洗晾干、觀察 血涂片，70%乙醇固定6min 晾干 甲基綠-派羅寧滴染20min 沖洗，吸干 丙酮分色（沾2-3次）晾干觀察 一小塊洋蔥表皮 甲基綠-哌羅寧滴染30-40min 滴水沖洗 蓋片、觀察,DNA, RNA,洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞甲基綠-哌羅寧染色 DNA被甲基綠染成綠色 RNA被哌羅寧染成紅色,細(xì)胞組織化學(xué)法：在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用某些化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀在通過顯微鏡對細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分進(jìn)行定位定性的檢測方法。 三氯醋酸的作用：抽提DNA 、RNA，使蛋白質(zhì)與DNA 、RNA分開。 固定：將細(xì)胞殺死，使其仍然保持原來的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。 甲基綠-哌羅寧染色原理：核酸是強(qiáng)性酸，甲基綠-哌羅寧是堿性染料，具有親和力，這兩種堿性染料有