Fascin基因在骨肉瘤中的表達及統(tǒng)計分析【摘要】 目的：探討Fascin基因在骨肉瘤組織中的表達及及統(tǒng)計分析。方法 ：收集武漢市四大三級甲醫(yī)院的骨肉瘤20例及良性骨軟骨瘤5例,將實驗分為骨肉瘤組(n=20)和良性骨軟骨瘤組(n=5),采用免疫組織化學方法檢測各組組織中Fascin基因的表達水平, 采用HPIAS 1000圖文報告管理系統(tǒng)對Fascin基因的表達進行定量分析，并用SPSS11.5軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗。結果：Fascin基因在骨肉瘤組織中呈高表達, Fascin基因在良性骨軟骨瘤組織中呈低表達, Fascin基因在骨肉瘤組織中的表達與良性骨軟骨瘤組織的表達比較差異有顯著性(P<0.05)。結論：Fascin基因在腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移等過程中有促進作用，提示Fascin基因可能與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。 【關鍵詞】 骨肉瘤; Fascin基因; 免疫組織化學; 圖像分析; 統(tǒng)計分析骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生長相應發(fā)病高峰期最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。其發(fā)生率約為0.1/10萬, 其惡性度高，進展快，預后差，且以青少年好發(fā)。多發(fā)于1020歲的青少年的長骨, 尤以股骨下段和脛骨上段多見1。占骨惡性腫瘤的20%左右,肺轉(zhuǎn)移是其主要死亡原因,80%的病例在確診時已有肺部微小轉(zhuǎn)移灶。骨肉瘤早期臨床癥狀無特異性,且病情進展較快,大多數(shù)病例就診時已經(jīng)進入臨床B期24。Fascin基因?qū)儆趂ascins家族,其蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物是一種結構獨特、進化保守的肌動蛋白( actin)交聯(lián)蛋白,位于細胞膜皺褶、微棘及應力纖維,在各種轉(zhuǎn)化細胞中促使細胞膜突起并增加細胞運動性。近年來的研究發(fā)現(xiàn), fascin在許多惡性腫瘤組織細胞中表達上調(diào),在惡性腫瘤的進展中起重要作用57。研究通過應用免疫組織化學方法和圖像分析技術檢測骨肉瘤及良性骨軟骨瘤組織中fascin基因的表達水平，并進行了統(tǒng)計學分析，探討Fascin基因在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，為臨床上防治骨肉瘤提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 材料來源及分組 收集武漢市四大三級甲醫(yī)院病理科20002008年骨肉瘤存檔蠟塊20例及良性骨軟骨瘤存檔蠟塊5例。所有切片經(jīng)病理學專家診斷為骨肉瘤及良性骨軟骨瘤。1.1.2 材料 采用免疫組織化學SP法檢測Fascin基因在骨肉瘤與良性骨軟骨瘤組織中的表達。1.2 主要試劑和儀器1.2.1 主要試劑Fascin兔抗人多克隆抗體(北京中山生物技術有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒(福州邁新公司);DAB顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中山生物技術有限公司)。1.2.2 主要儀器 YWY781型醫(yī)用微波儀，250 W，50 Hz (浙江臨安電子器材廠生產(chǎn)); 家用高壓鍋; 電熱恒溫干燥箱 (湖北黃石醫(yī)療器械廠生產(chǎn)); 顯微鏡成像系統(tǒng) (Olympus公司)。1.3 方法蠟塊切片厚5m，貼片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上，置于烤箱烤干待用。免疫組織化學SP法檢測Fascin基因相關抗原 具體步驟： 4m組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 抗原修復(檸檬酸緩沖液微波抗原修復法)，室溫自然冷卻后，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗53 min; 滴加3%過氧化氫，37濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 正常羊血清37濕盒孵育10min以減少非特異性背景; 甩去多余血清，分別滴加一抗，4孵育過夜，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗35 min; 滴加生物素標記的二抗37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物復合物37濕盒孵育10min，0.01M PBS(pH 7.4)漂洗33 min; 滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間(約35 min)，自來水沖洗終止反應; 蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍; 梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢;用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為陽性對照組。1.4 免疫組織化學結果判斷Fascin陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細胞核和胞質(zhì)內(nèi)。陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。采用HPIAS1000 高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)對Fascin基因的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(400) ,測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積,計算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應的總面積/單位面積中細胞的總面積100%)。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差表示，用SPSS11. 5 軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK(q) 檢驗，檢驗水準為0.05。2 結果Fascin基因的表達：在骨肉瘤組中可見密集分布的棕黃色顆粒，F(xiàn)ascin基因表達呈陽性;在良性骨軟骨瘤組中可見少量的棕黃色顆粒，F(xiàn)ascin基因表達弱陽性或陰性。圖像分析結果顯示: 骨肉瘤組Fascin基因表達的平均光密度為0.26590.009, 良性骨軟骨瘤組Fascin基因表達的平均光密度為0.08860.0043; 骨肉瘤組Fascin基因表達的陽性面積率為0.29940.0080, 良性骨軟骨瘤組Fascin基因表達的陽性面積率為0.09870.0056,經(jīng)單因素分析骨肉瘤組與良性骨軟骨瘤組比較，差異有顯著性(P<0.05)。見表1。表1 骨肉瘤組與良性骨軟骨瘤組Fascin基因表達的平均光密度和陽性面積率3 討論原發(fā)性惡性骨腫瘤是罕見的，只占所有新癌癥病例的0.2%。這些罕見腫瘤的治療是復雜的，對骨外科來說是一項重大的挑戰(zhàn)。骨肉瘤是青春期正常骨骼快速生長相應發(fā)病高峰期最常見的原發(fā)性骨腫瘤。近年來強度新佐劑和佐劑化療的使用使得這種疾病患者得以存活。無復發(fā)存活率已經(jīng)從沒有進行化療的不足20%提高到了使用手術和多代理化療相結合治療的55%70%810。完全手術切除和術前化療良好的組織學反應是患者疾病定位最重要的預后指標。患者術前化療反應良好(>90%壞死)5年存活率為75%80%，與此相比那些化療反應差的(<=90%壞死)為45%55%。 盡管整體存活率(OS)有所提高，但是有相當一部分患者會發(fā)展為復發(fā)性疾病，這種情況最常見于肺部轉(zhuǎn)移1112。因此需要一線治療的新方法來提高存活率。這種罕見癌癥治療的新方法是臨床研究者最大的挑戰(zhàn)。因此, 近些年有許多學者著重研究骨肉瘤的分子發(fā)病學, 為觀察骨肉瘤預后和轉(zhuǎn)移尋找新的指標, 也為尋找骨肉瘤新的治療方法提供了理論基礎。人類Fascin基因是由Bryan等1320 世70 年代從海膽母細胞中發(fā)現(xiàn)的,其蛋白質(zhì)編碼產(chǎn)物是一種分子量為55 kDa 的細胞骨架蛋白1415,Fascin蛋白N端1150之間的氨基酸殘基高度保守,其中第39位的絲氨酸為蛋白激酶C的磷酸化位點,該位點的磷酸化可調(diào)節(jié)Fascin蛋白與F肌動蛋白的結合活性以及細胞膜表面絲狀偽足和微棘的形成,提示Fascin蛋白可能在細胞遷移、細胞黏附以及細胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用16，17。研究發(fā)現(xiàn), 在正常上皮細胞中Fascin表達較低或缺失, 然而在胃癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤中Fascin1 表達上調(diào)1820。本實驗結果顯示，F(xiàn)ascin基因在骨肉瘤的表達明顯高于對照組(P<0.05)，骨肉瘤組與對照組比較(P<0.05)，差異有顯著性。Fascin蛋白是一種進化保守的、與肌動蛋白結合的55 kDa的細胞內(nèi)蛋白,它的主要功能是與肌動蛋白結合,并將其捆綁成平行的肌動蛋白束,使細胞形成線狀(filopodia)或片足( lamelipodia)的突起,從我們的結果中說明Fascin使腫瘤細胞的運動性增加,侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。結果證實Fascin基因在腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移等過程中有促進作用，提示Fascin基因可能與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。Fascin可作為判斷骨肉瘤生物學行為的新參考指標。【參考文獻】 1Meyers P, Schwartz C, Krailo M, et al. 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