補腎活血法組方中藥防治腎間質(zhì)纖維化的實驗研究ExperimentalstudyregardingtoprotectiVeandtherapeUticeffects0fNourishingkidneyandActiVingbloodonrenalinterstitialfibrosis張大寧張勉之ZHANGDa-ningZHANGMian-zhi天津市中醫(yī)藥研究院（中國300120）TianjinAcademyofTraditionalChineseMedicinePresident(China300120)中圖分類號：R322.6+2文獻標識碼：A文章編號：18180086（2009）03摘要：目的探討依據(jù)補腎活血法組方對進展性腎間質(zhì)纖維化的防治作用。方法制作大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，將大鼠分為假手術(shù)組，高、低劑量治療組和模型組。觀察腎間質(zhì)病變的程度及角蛋白、波形蛋白和-平滑肌肌動蛋白在腎間質(zhì)的表達情況。結(jié)果治療組腎間質(zhì)損害程度明顯輕于模型組(P0.01)；波形蛋白、-平滑肌肌動蛋白陽性細胞表達明顯少于模型組，角蛋白的表達明顯多于模型組(P0.01)。結(jié)論補腎活血法中藥使肌成纖維細胞的表達減少，上皮細胞的表達增強，說明抑制并逆轉(zhuǎn)了腎小管上皮細胞肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，阻止了腎間質(zhì)纖維化的進程。關(guān)鍵詞：補腎活血法；腎間質(zhì)纖維化Abstract:Objective：ToinvestigatetheprotectiveandtherapeuticeffectsofNourishingkidneyandActivingbloodonprogssivefibrosisinrenalinterstitialMethodsTheratmodelsofrenalinterstitialfibrosis，dividedintopseudoperationgroup，therapeuticgroupandmodelgroupThepathologicalchangesandexpressionof-SMA，VimandstitiinrenalinterstitialfibrosisResultsThelesionofrenalinter-therapeuticgroupweresignificantlybetterthanthoseofthecontrolgroup(P0.01).Thenumberof-SMAandVimpositiveexpressionintherapeuticgroupwerelessthanthoseinmodelgroup,thenumberofCKwasonthecontrary(P0.01).ConclusionApplytheformulaofNourishingkidneyandActivingbloodcanreducetheMyofibroblastexpressionandincreasetheepithelialcellsexpression，inhibitedandtransformedTEMT，blockagerenalinterstitialfibrosisKeyWords:NourishingkidneyandActiving；bloodRenalinterstitial；fibrosisTreatment腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis，RIF)是各種腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)果；近年來的研究顯示腎間質(zhì)病變與慢性腎衰竭關(guān)系較腎小球更為密切1-2。補腎活血法(NourishinkidneyandActivingblood)是張大寧氏于1978年首先出的一種新的中醫(yī)理論和臨床治療大法3。我們利用腎間質(zhì)纖維化動物模型，通過檢測角蛋白(CytokeratinCK)、波形蛋白(VimentinVim)和-平滑肌肌動蛋白(Otsmoothmuscleaction-SMA)等特異性標志物的表達，觀察該中藥對腎間質(zhì)纖維化的防治作用。1材料1.1動物：雄性Wistar大鼠32只，清潔級，體重220g286g(251.6718.32g)，由河北省實驗動物中心提供。1.2藥物：根據(jù)補腎活血法組方，選取生黃芪、川芎、赤芍、鱉甲、甘草等，購自天津市藥材公司，并經(jīng)天津市中醫(yī)藥研究院鑒定。草藥一并于多功能提取罐內(nèi)，用65乙醇熱回流提取兩次，第一次加8倍量65乙醇，提取3小時，放出藥液，第二次加6倍量65乙醇，提取2小時，放凈藥液。二次藥液一并濾過，7075回收乙醇，回醇后再減壓濃縮(70C，0.06MPA)至相對密度為1.351.40(85熱測)的稠膏，出膏率10。1.3試劑：抗-SMA單克隆抗體(sigma公司)、抗波形蛋白單克隆抗體、抗角蛋白單克隆抗體(SantaCruz公司)，均為第一抗體；生物素標記的抗小鼠IgG抗體及抗兔IgG抗體(華美公司)，均為第二抗體。1.4儀器：CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)由北京航空航天大學研制。2方法2.1模型制備及給藥：雄性Wistar大鼠32只，其中24只在無菌條件下行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)(UnilateralUreteralobstruction，UUO)4，術(shù)后隨機分成治療組和模型組，治療組于UUO手術(shù)第一天起給中藥，根據(jù)動物體重，高、低兩個劑量灌胃，每一劑量8只動物，分別是4.0gkg-1d-1和2.0gkg-1d-1，模型組8只動物予等量溫水。其余8只行假手術(shù)，只找到輸尿管，并不結(jié)扎，常規(guī)喂養(yǎng)。實驗期間自由飲水、攝食、室內(nèi)溫度控制在2024左右、通風濕度良好。灌胃3周后，處死動物。2.2標本制備：腎組織標本用10的中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水、包埋，切成2m的切片，作HE、PASM染色；另一些標本做成4m，切片脫蠟水化后，用3過氧化氫(H202)溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶(10分鐘)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗(35分鐘)，在微波緩沖液中微波修復10分鐘，羊血清白蛋白封閉(20分鐘)，依次加入一抗(抗-SMA抗體，抗波形蛋白單克隆抗體，抗角蛋白單克隆抗體)。4冰箱孵育過夜，加入二抗(生物素標記的抗小鼠IgG抗體及抗兔IgG抗體)37孵育30分鐘，鏈霉素卵白素復合物(ABC)37孵育30分鐘，用DAB顯色液顯色35分鐘，蘇木素復染3分鐘，最后用樹脂封片。每批標本均做陰性及陽性對照。腎組織免疫組化標本通過光學顯微鏡放大200倍攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，進行免疫組織化學定量分析，在200倍光學顯微鏡下每個標本隨機選取10個無腎小球的視野，計算每個視野內(nèi)腎小管上皮細胞內(nèi)免疫組化陽性面積和腎小管上皮細胞總面積的比值，取其平均值為每例標本腎小管上皮細胞陽性表達的比較值。2.3結(jié)果判定和記錄：HE、PASM染色切片在光鏡下觀察腎間質(zhì)炎細胞浸潤及間質(zhì)病變。將腎小管間質(zhì)病變程度分為級。即I級：小管間質(zhì)病變散在輕微，范圍15；級：病變呈灶性或小片狀分布，15；級：病變呈灶性或小片狀或彌漫分布，范圍50。免疫組化-SMA染色主要以腎間質(zhì)血管平滑肌作為陽性對照，除此以外-SMA陽性細胞記錄其量的差別，即：每一切片用10x40倍光鏡觀察大鼠腎間質(zhì)5處病變最為明顯的區(qū)域，記錄其陽性細胞數(shù)。按每個高倍視野-SMA陽性細胞數(shù)量的多少分為5級：300為級。2.4統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差(S)表示，根據(jù)數(shù)據(jù)的性質(zhì)與分步情況，計數(shù)資料采用X2檢驗，計量資料采用t檢驗，等級資料采用秩和檢驗。3結(jié)果3.1光鏡：HE、PASM染色切片可見模型組出現(xiàn)彌漫性炎細胞浸潤、間質(zhì)水腫，伴有不同程度的上皮細胞腫脹、變性及部分腎小管萎縮、管腔閉塞，腎間質(zhì)出現(xiàn)多灶性纖維化，范圍50，屬于級；高、低劑量治療組分別可見部分腎小管上皮細胞發(fā)生空泡變性，少數(shù)腎小管上皮細胞發(fā)生空泡變性增加并伴有部分腎小管上皮細胞核發(fā)生脫落，腎間質(zhì)病變呈片狀分布，范圍15，屬于I級，較模型組比較有顯著性差異。腎小管面積、管腔面積及管壁面積與模型組比較明顯增加，有非常顯著性差異(P001)，腎間質(zhì)面積較模型組比較明顯縮小(P001)，其中高劑量組效果更為明顯，但高、較低劑量組比較無顯著性差異；假手術(shù)組未見病理改變。表1腎小管、腎間質(zhì)面積測量統(tǒng)計結(jié)果假手術(shù)組低劑量治療組高劑量治療組模型組腎小管面積182.8811.69175.2515.38164.3616.22122.3814.02腎小管腔面積46.432.7236.011.5228.15I.6918.333.74腎小管壁面積161.0314.9147.219.36127.4910.34101.3513.26與模型組相比較：P0.01；與假手術(shù)組比較：p0.013.2腎組織免疫組織化學檢測3.2.1-SMA和Vim的表達分布：假手術(shù)組極少量-SMA和Vim的表達；高、低劑量治療組分別可見-SMA和波形蛋白在腎小管上皮細胞胞漿內(nèi)有少量表達，每高倍視野-SMA和Vim陽性細胞數(shù)均少于200，其中高劑量組效果更為明顯，但較低劑量組無顯著性差異；模型組-SMA和Vim表達明顯增加，腎間質(zhì)陽性細胞數(shù)均大于220，較治療組有非常顯著性差異(P0.01)。3.2.2CK的表達分布：假手術(shù)組角蛋白有較強的表達；治療組角蛋白表達減弱；模型組：CK的表達進一步減少，相比治療組有非常顯著性差異(P0.01)。表2腎組織免疫組化結(jié)果假手術(shù)組低劑量治療組高劑量治療組模型組CK0.20980.02350.1576壬0.01890.17250.01720.06510.0063-SMA0.00070.00010.01580.00160.00670.001l0.0843士0.019Vim0.00110.00220.03380.00580.02850.00370.11220.0236與模型組相比較：P0.0l；與假手術(shù)組比較：P0.0l4討論張大寧教授研制的以補腎活血法為大法的該種中藥，具有補腎、活血、軟堅的功效，改善腎虛血瘀的病理變化，使機體陰陽平衡、邪祛正存。其中生黃芪含有甙類、多糖、氨基酸及微量元素，具有增強機體免疫功能、利尿、保肝、消除蛋白尿的作用；川芎含有川芎嗪、阿魏酸及內(nèi)脂素等，可提高7球蛋白及T淋巴細胞，對免疫系統(tǒng)有一定調(diào)整作用；赤芍含有赤藥甙、牡丹酚、芍藥花甙等，可提高耐缺氧能力、抗血栓形成及改善微循環(huán)；鱉甲含有動物膠、角蛋白、碘質(zhì)及維生素D等，能抑制肝、脾之結(jié)締組織增生，提高血紅蛋白水平；甘草含有甘草次酸及多種黃酮成分，有類似腎上腺皮質(zhì)激素樣作用。諸味藥配伍可調(diào)節(jié)機體免疫功能，改善微循環(huán)，軟堅散結(jié)，提高組織損傷后的修復能力。近年來腎小管間質(zhì)損害在腎臟疾病中的作用日益受到國內(nèi)外學者的重視5-6。各種原因引起的腎小球疾病常常伴隨著腎小管間質(zhì)損傷，腎間質(zhì)纖維化是所有慢性進行性腎臟疾病進展到終末期腎衰的共同形態(tài)學特點，決定著腎臟疾病的預(yù)后，小管間質(zhì)病變的嚴重程度與腎小球濾過率的下降密切相關(guān)7。有關(guān)研究證實，在不伴有腎小管間質(zhì)纖維化的腎臟疾患，腎功能惡化甚至腎小球硬化進展緩慢8。小管間質(zhì)纖維化的過程包括小管細胞的喪失和細胞外基質(zhì)(ECM)的積聚9。腎小管間質(zhì)中的肌成纖維細胞(Myofibroblast，MyoF)是合成細胞外基質(zhì)I型和型膠原的主要細胞，是腎纖維化中使細胞外基質(zhì)沉積增多的主要原因之一10，是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一11。MyoF可來自成纖維細胞，也可由腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化而來，能特異性表達間充質(zhì)細胞的標志物-SMA和Vim，而正常腎小管上皮細胞可表達角蛋白12。在腎組織無損傷或僅發(fā)生輕度損傷時腎小管上皮細胞仍表達角蛋白，以后隨著腎小管上皮細胞損傷逐漸加重，角蛋白的表達開始減弱，與此同時可見部分損傷的腎小管上皮細胞表達-SMA、波形蛋白，并表達逐漸增強，以后出現(xiàn)型膠原的表達，使腎間質(zhì)中基質(zhì)增多，發(fā)生纖維化。UUO是國內(nèi)外學者公認的腎間質(zhì)纖維化模型，伴隨著疾病的進展間質(zhì)細胞增多，膠原分泌增加，最終導致腎間質(zhì)纖維化。本實驗證實，應(yīng)用補腎活血法為大法的中藥，可抑制腎小管上皮細胞肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，使MyoF的表達減少，抑制纖維細胞的活化，從而抑制了腎間質(zhì)纖維化的形成和發(fā)展。參考文獻：1BohleA,MullerGA,WehrmannM,eta1.Pathogenesisofchronicrenalfailureintheprimaryglomerulopathies,renalvasculopathiesandchronicinterstitialnephrifidesJ.KidneyInt,1996,49:22HealyE,HughRB.RoleoftubuleepithelialcellsinPathogdnesisoftubulointerstitialfibrosisinducedbyglomerulardiseaseJ.CurtOpinNephrolHypertens,1998,7:5253ZhangDaningeta1,ThestudyofTCMNourishingkidneyandActivingblood.FirstEdition.(中醫(yī)補腎活血法研究)MPeking:Chinamedicinetechnologypublishinghouse,1997.4YangJ,LiuY.DelayedadministrationofhepatocytegrowthfactorreducesrenalfibrosisinobstructivenephropathyJ.AmJPhysiolRenalPhysiol,2003,284:F34957.5FrazierKS,ParedesA,DubeP,eta1.Connectivetissuegrowthfactorex-pressionintheratremnantkidneymodelandassociationwithtubularepithelialcellsundergoingtransdifferentiationJ.VetPathol,2000,37:32835.6LanHY.Tubularepithelial-myofibroblasttransdifferentiationmechanismsinproximaltubulecellsJ.CurtOpinNephrolHypertens,2003,12:2597YangJ,LiuY.BlockageoftubularepithelialtomyofibroblasttransitionbyhepatocytegrowthfactorpreventsrenalinterstitialfibrosisJ.JAmSocNephrol,2