四川大學碩士學位論文 馬拉色菌蛋白酶、脂酶活性的研究 研究生: 導師: 曾蔚 賈文祥 目 的 檢測不同來源馬拉色菌菌株的蛋白酶、 脂酶活性，比較臨床 株和正常皮膚分離株酶活性的差異， 并研究酶活性與其致病性的關系。 方 法從花斑癬患者、 包皮龜頭炎患者和腎移植患者腹股溝膿腫分離鑒定馬 拉色菌臨床株; 從患者正常皮膚及健康人皮膚分離鑒定馬拉色菌正常皮膚 分離株。 使用全脂牛奶平板法、 b s a 平板法檢測馬拉色菌7 株標準株、 3 3 株糠批馬拉色菌、1 2 株合軸馬拉色菌、4 株鈍形馬拉色菌臨床分離株和 2 8 株糠批馬拉色菌正常皮膚分離株的蛋白酶活性，并檢測有關溫度、p h 值和蛋白 酶抑制劑對蛋白酶活性的影響。 使用對硝基苯擱酸醋作為脂酶特 異性底物， 檢測3 3 株糠批馬拉色菌臨床株和2 8 株正常皮膚分離株的脂酶 活性。 選擇蛋白 酶、 脂酶活性不同的3 株菌通過靜脈內 注射方式感染免疫 抑制小鼠， 以小鼠 死亡率和平均生存時間作為評價菌株毒力的指標。 結果 了 株馬拉色菌標準株均被檢出蛋白 酶活性; 糠批馬拉色菌臨床分離株蛋白 酶、脂酶活性均高于正常皮膚分離株 ( f x . 0 1 );蛋白 酶活性在3 2 c. p h 5 . 5 條件下表達最高， e d t a 能 抑制蛋白 酶活性。 動物試驗表明蛋白 酶、 脂酶活性愈高的菌株， 相應小鼠死亡率愈高， 平均生存時間愈短。 結論非 嗜脂性和嗜脂性的7 株馬拉色菌標準株均具有蛋白酶活性; 全脂牛奶平板 四川大學碩士學位論文 法是一項簡便、 可靠的測定馬拉色菌蛋白酶活性的方法; 糠稚馬拉色菌臨 床分離株的蛋白 酶、 脂酶活性高于正常皮膚分離株; 蛋白酶、 脂酶的活性 與菌株的致病性相關。 i 關鍵詞】 馬拉色菌 蛋白酶 脂酶 致病性 四川大學碩_ ! 二 學位論文 s t u d y o n t h e p r o t e i n a s e a n d l i p a s e a c t i v i t y o f ma l a s s e z i a p o s t g r a d u a t e tu t o r z e ng w e i j i a we n x i a n g o b j e c t i v e s t r a i n s i s o l a t e d t o s t u d y t h e p r o t e i n a s e a n d l ip a s e a c t i v i t y o f m a l a s s e z i a f r o m v a r i o u s s p e c i m e n s 幾rt h e r mo r e r e s e a r c h t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p r o t e i n as e , l i p a s e a c t i v i t y a n d p a t h o g e n i c i t y . me t h o d s t o t a l l y 7 s t a n d a r d s t r a i n s o f m a l a s s e z i a s p p ; 3 3 o f mf u rf u r ， 1 2 o f ms y m p o d i a l i s , 4 o f mo b t u s a i s o l a t e d f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s a n d 2 8 o f m f u rf u r i s o l a t e d f r o m h e a l t h y p e r s o n w e re c u l t u r e d o n t h e w h o l e - f a t - c o w s - m i l k p l a t e a n d b s a p l a t e a t 3 2 0 c f o r 1 4 d a y s r e s p e c t i v e l y t o t e s t t h e i r p r o t e i n a s e a c t i v i t i e s . t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e , p h a n d p r o t e i n as e i n h i b i t o r o n t h i s a s s a y w a s a l s o e v a l u a t e d . p - n i t r o p h e n y p a l mit a t e w a s u s e d a s l i p a s e s u b s t r a t e t o d e t e c t t h e l i p a s e a c t i v i t y o f 3 3 s t r a i n s o f mf u rf u r i s o l a t e d f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s a n d 2 8 o f 從f u rf u r i s o l a t e d fr o m n o r m a l p e r s o n . t h e m o rt a l it y r a t e a n d a v e r a g e s u r v i v a l t i m e o f i m m u n e - c o m p r i s e d m i c e i n j e c t e d w i t h t h r e e i s o l a t e s o f d i f f e r e n t p r o t e i n a s e , l i p a s e a c t i v i t i e s w a s o b s e r v e d t o d e t e r mi n e p a t h o g e n i c it y . i n t h e 7 s p e c ie s l i p a s e a c t i v i t y r e s u l t s a c t iv i t y o f p r o t e i n a s e w i t h d i f f e r e n t l e v e l s s h o o f p r o t e i n a s e , o f m a l a s s e z i a . t h e r e w a s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e mf u rf u r i s o l a t e d f r o m c l i n i c a l 四川大學碩士學位論文 s p e c i m e n s a n d n o r m a l p e r s o n ( p 0 .0 1 ) . t h e o p t i m a l t e m p e r a t u r e a n d p h f o r e x p r e s s i n g t h e p r o t e i n a s e a c t i v i t y a r e 3 2 c a n d p h 5 . 5 r e s p e c t i v e l y . t h e p r o t e in a s e a c t i v it y c o u ld b e i n h i b i t e d b y e d t a . a n i m a l e x p e r i m e n t s h o w e d t h a t t h e h ig h e r p r o t e i n a s e , l i p a s e a c t i v i t y w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e h i g h e r m o r ta l it y r a t e a n d s h o rt e r a v e r a g e s u r v i v a l t i m e . c o n c l 哪 io n a ll t h e 7 s p e c i e s o f m a l a s s e z i a s h o w e d a c t i v i t y o f p r o t e in a s e w i t h d i f f e r e n t le v e l s . i t s t h e s i m p l e a n d r e l i a b l e m e t h o d t o d e t e c t t h e a c t i v it y o f p r o t e i n a s e b y t h e w a y o f w h o l e - f a t - c o w s - m i l k p l a t e m e t h o d i n t h e l i p o p h i l i c y e a s t o f m a l a s s e z ia . t h e p r o t e i n a s e , l i p a s e a c t i v i t y o f 從1 動 晌r i s o l a t e d fr o m c l i n i c a l s a m p l e s w e r e h i g h e r t h a n t h a t o f w h i c h i s o l a t e d fr o m n o r m a l p e r s o n . i t s e e m s t h a t t h e p r o t e i n a s e a n d l i p a s e a c t i v it y m a y c o r r e l a t e w i t h t h e v i r u l e n c e . k e y w o r d s ma l a s s e z i a p r o t e i n a s e l i p a s e p a t h o g e n i c i t y 部分專業(yè)英語單詞: m a l a s s e z i a :馬拉色菌 m p a c h d e r m a t i s : 厚皮馬拉色菌 m . s l o o f i a e :斯洛菲馬拉色菌 m . a l o b o s a : 球形馬拉色菌 p r o t e i n a s e : 蛋白 酶 p - n it r o p h e n y p a l m i t a t e : p i t y r i a s i s v e r s i c o l o r : 對硝基苯擱酸酷 花斑癬 m . f u r f u r :糠批馬拉色菌 m . s y m p o d i a l i s : 合軸馬 拉色菌 m . o b t u s a :鈍形馬拉色菌 m . r e s t r i c t a : 限制性馬拉色菌 l i p a s e :脂酶 b a l a n o p o s t h i t i s : 包皮 龜頭炎 a b s c e s s o f g r o i n : 腹股溝膿腫 四川人學碩士學位論文 馬拉色菌蛋白酶、脂酶活性的研究 前言 馬拉色菌 ( m a l a s s e z i a )是人類和溫血動物皮膚的常駐菌群，亦是一 種條件致病真菌。 根據生理生化和分子生物學特性， 馬拉色菌分為了 個種 分別為厚皮馬拉色菌 ( m . p a c h d e r m a t i s )、合軸馬拉色菌 ( m . s y m p o d i a l i s )、糠批馬拉色菌( m . f u r f u r ) ,斯洛菲馬拉色菌 ( m . s l o o f i a e ) 、鈍形馬拉色菌( m . o b t u s a ) 、球形馬拉色菌o f . g 1 o b o s a ) 和 限制性馬拉色菌( . . r e s t r i c t a ) 。除厚皮馬拉色菌外， 其余6 種均為 嗜脂 性酵母菌。馬拉色菌相關皮膚病 ( m a s d ) 有花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂 溢性皮炎、 特應性皮炎、銀屑病等疾病2 。 “ ， ，可分為二型: 一型是以馬拉 色菌高密度粘附在皮膚角質層細胞上為特點， 如花斑癬、 馬拉色菌毛囊炎; 另 一型以 低密 度的 粘附伴炎 癥反 應為 特點， 如脂溢性 皮炎、 特應性 皮炎川。 馬拉色菌在皮膚角質層細胞上的粘附能力與菌體所分泌的侵襲性酶 密切相關， c o u t i n h o c l 等己 采用平板法測得馬拉色菌屬中 非嗜脂 性的厚 皮馬拉色菌能分泌蛋白 酶。 近年的研究表明真菌的蛋白 酶參與真菌對表皮 的 侵 襲和 粘附 過程， 與 致病 性 相 關目 。 但目 前尚 不 清楚 馬 拉 色 菌 屬中 其 他6 種嗜脂性的馬拉色菌， 如糠批馬拉色菌、 合軸馬拉色菌等是否也能產 生蛋白酶:也不清楚馬拉色菌的蛋白酶是否與致病性相關。 馬拉色菌在皮膚上粘附引起炎癥反應的能力也與脂酶有關，己 有的 研究表明糠批馬拉色菌的脂酶能分解三酞甘油成游離脂肪酸為菌體生長 四川大 學碩士學位論文 b 供能量， 對糠批馬拉色菌的生長起關鍵作用下 : 脂酶活性升高也有利于 當 拉色菌由 酵母相向菌絲相轉化， 使該菌從寄生性向 致病性轉變8 1 ， 在花 xf 癬、 包皮龜頭炎等患者皮損區(qū)的鱗屑中我們可觀察到大量的馬拉色菌菌 t 體。 為進一步明確馬拉色菌蛋白酶、脂酶的生物學特性及其致病性，本 矢 驗從以下方面進行研究: 、從花斑癬患者、包皮龜頭炎患者和腎移植患者腹股溝膿腫分離鑒定馬 拉色菌臨床株，從患者正常皮膚及健康人皮膚上分離鑒定馬拉色菌正 常皮膚分離株。 2 、改進測定蛋白酶活性的方法，使用全脂牛奶平板法、b s a 平板法檢測 馬拉色菌7 株標準株、3 3 株糠批馬拉色菌、1 2 株合軸馬拉色菌、4 株 鈍形馬拉色菌臨床分離株和2 8 株糠批馬拉色菌正常皮膚分離株的蛋 白 酶活性，并檢測溫度、 p h 值和蛋白 酶抑制劑對蛋白 酶活性的影響。 3 、使用對硝基苯擱酸酷為脂酶特異性底物檢測3 3 株糠稚馬拉色菌臨床 株和2 8 株正常皮膚分離株的脂酶活性。 4 、 選擇蛋白 酶、脂酶活性不同的3 株菌采用靜脈內注射方式感染免疫抑 制小鼠進行毒力實驗， 以小鼠死亡率和平均生存時間來評價菌株毒力。 四川大學碩十學位論文 第一部分馬拉色菌菌種的分離鑒定 材料與方法 ( 一)培養(yǎng)基: t 、沙保培養(yǎng)基:質量分數為 1 %蛋白脈，4 %葡萄糖， 2 % 瓊脂，0 .0 5 %氯 霉素，0 .0 5 %放線菌酮。 2 、菜子油培養(yǎng)基:質量分數為 1 %蛋白 陳，4 % 葡萄糖，0 .0 1 %酵母浸膏， 1 . 8 % 瓊脂，0 .2 5 %單硬脂酸甘油醋，1 %吐溫一 8 0 , 2 %菜子油，0 .0 5 %氯霉 素， 0 .0 5 % 放線菌酮。 5 、 七葉營培養(yǎng)基: 含菜子油的培養(yǎng)基中加入0 . 1 % 七葉昔和0 . 2 % 構椽酸鐵。 ( 二) 標準菌株 1 、 合 軸馬拉色菌 ( ms y m p o d i a l i s c b s 7 2 2 2 ) 2 , 糠 批馬拉色菌 ( m f u rf u r c b s 1 8 7 8 ) 3 、鈍形馬拉色菌 ( m. o b t u s a c b s 7 8 6 8 ) 4 、 斯洛菲馬拉色菌 ( m s l o o fa e c b s 7 9 5 6 ) 5 、 球形馬拉色菌 ( mg l o b o s a c b s 7 9 6 6 ) 6 、限制性馬拉色菌 ( mr e s t r i c t a c b s 7 8 7 7 ) 7 、 厚皮馬 拉色菌 ( mp a c h y d e r m a t is c b s 1 8 7 2 ) 由四川大學華西醫(yī)院皮膚性病科冉玉平教授提供。 ( 三)臨床分離株和正常皮膚分離株的采集、分離與鑒定 1 、臨床分離株采集對象為2 0 0 1 年6 月至2 0 0 2 年5 月在四川大學華西醫(yī) 院皮膚性病科臨床診斷為花斑癬、 包皮龜頭炎的患者， 以及一例腎移植術 后腹股溝膿腫患者。 四川大學碩 1 : 學位論文 納入標準: 典型的臨床表現; 皮損區(qū)皮屑直接鏡檢菌絲及抱子陽性; 2 周內局部未使用過抗真菌制劑; . 1 月內未服用過抗真菌藥物。 2 、正常皮膚分離株采集對象為: 臨床患者的非皮損區(qū); 華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院微生物學教研室的教師和研究生， 無毛囊炎、 脂溢性皮炎等馬拉色菌相關性疾病。 3 、標本的采集區(qū)域: 臨床患者的皮損區(qū); 非皮損區(qū)采集額、胸、背部區(qū)域。 4 、采集方法:采用膠帶粘貼法19 1 ， 使用高壓蒸汽滅菌的一次性微孔透氣 膠帶( 3 m中國有限公司) ， 粘貼于取材部位， 每個部位粘貼約 1 - 2 分鐘后， 無菌平鑷取下，分別貼于沙保培養(yǎng)基和含菜子油培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察3 - 4 周，待菌落長出 后挑選不同形態(tài)的菌落， 經5 0 % 派克墨水一 1 0 % k o h染色 后置鏡下觀察， 確定為馬拉色菌后， 轉種菜子油培養(yǎng)基平板， 進行生化鑒 定。 腎移植術后腹股溝膿腫患者采集病灶中膿液及壞死組織， 用平板劃線 法分離馬拉色菌菌株。 5 、 菌種鑒定:采用g u i l l o t 報告的對該菌形態(tài)學和生理生化特性的鑒定方 法進行鑒定。鑒定的過程見圖 l a 四川大學碩十學位論文 圖 i 馬拉色菌屬分類鑒定流程圖 標本 + 莢子油培養(yǎng)基 + 可疑菌落 寺 沙保培養(yǎng)基 陽性厚皮馬拉色菌 過氧化氫酶試驗 陽性 吐溫試驗和l k 麻油試驗 陰性 限制性馬拉色菌 吐溫- 皮膚病學領域則命名為糠秋抱子菌 ( t h e g e n u s p i r v r o _r p o r u m ) ，分為卵形糠稚抱子菌 ( p i t v r o s p o r u m o v a l ) ,圓 形糠批袍子菌( p i t _v r o s p o r u m o r b i c u l u r e ) 和厚皮糠批抱子菌。長期以來 文獻上對馬拉色菌的分類鑒定方法多種多樣，有形態(tài)學、生理學的鑒定， 也有血清學的鑒定。 2 , 1 9 9 6 年， g u e h o 0 等用比 較系 統的 方法對7 種馬 拉色菌的多個菌株進 行形態(tài)學和生理生化的描述，包括菌落形態(tài)， 抱子特征，過氧化氫試驗， 沙保培養(yǎng)基上生長能力，不同溫度的生長能力，吐溫利用情況。同年， g u i i l o t ! 等又用該菌屬的7 個種的多株菌株進行檢測，總結出較為全面 的鑒定方法:( 1 ) 分離培養(yǎng)菌種;( 2 ) 沙保培養(yǎng)基上的生長能力;( 3 ) 過 氧 化 氫 酶 試 驗 ; ( 4 ) 吐 溫 試 驗; ( 5 ) 顯 微 鏡 觀 察 。 1 9 9 7 年m a y s e r 等 ” ，在 g u i l l o t 的基礎上增加了2 種檢測手段: ( 1 ) p e g - 3 5 蓖麻油作為脂源的生 長能力:( 2 ) 分解七葉普的能力。 進一步為合軸馬拉色菌、 糠批馬拉色菌、 斯洛菲馬拉色菌的鑒定提供了依據。 g u i i l o t 的分類方法具有簡便， 經濟， 準確的 特點， 使馬拉色菌命名 及分類長期的混亂局面到達一個比 較統一的 現狀， 對于 f 1v 明各菌種與各種 皮膚病的關系具有重要的意義。 4 , 9 0 年代至今.基因分型的研究逐漸開展，主要方法有依靠檢查馬拉色 菌核 型 的 脈 沖 場凝 膠電 泳( p u l s e d f i e l d g e l e l e c t o p h o r e s i s , p f g e ) 和 鑒定。 a 隨機引物擴增條帶的隨機擴增多 態(tài)性分析 ( r a n d o m a m p l i f i l e d 四川大學碩士學位論文 p o l y m o r p h i c d n .a , r a p d ) 0 1 ，以 及r r n a 序列分析及d n a 堿基對比較 ， 。 馬拉色菌的鑒定與分型更加地精確可靠。 目 前國際上公認馬拉色菌屬包含 了個菌種，分別為厚皮馬拉色菌 ( ;n p a c h d e r m a t i s ) 、合軸馬拉色菌 ( m . s y m p o d i a l i s ) .糠批馬拉色菌 (. f u r p u r ) 、斯洛菲馬拉色菌( k i, s l o o f i a e ) .鈍形馬拉色菌( w . o 6 t u s a ) . 球形馬拉色菌( a l. g l o b o s a ) 和限制性馬拉色菌( .m . r e s t r i c t a ) 。 除厚皮馬拉 色菌外， 其余6 種均為嗜脂性酵母菌。 厚皮馬拉色菌雖然可以不需要脂質 但培養(yǎng)基中加入脂質可促進其生長。7 種不同的馬拉色菌病原菌中， 在臨 床上對人類有重要意義的是糠批馬拉色菌， 它被公認為是花斑癬和系統性 感染的主要致病菌， 而厚皮馬拉色菌則是引起貓、 狗等動物外耳炎以及脂 溢性皮炎的主 要病原菌 14 1 本實驗采用g u i l l o t 對馬拉色菌的生理生化鑒定方法， 從臨床標本和 健康人群中分離鑒定出馬拉色菌菌株， 供下一步研究使用。 四川大學碩士學位論文 第二部分 馬拉色菌蛋白酶、脂酶活性 的測定與致病性研究 材料與方法 ( 一)蛋白酶活性測定方法 培養(yǎng)基 全脂 牛奶 培養(yǎng) 基: 瓊脂2 g , 葡 萄 糖4 g 加 蒸 餾 水9 5 m l ， 高 壓滅 菌后 待 、l .r.月l 溫度下降至6 0 1c 每一平板約 冰箱保存， 1 6 m 1 ，加入5 m l 無菌全脂牛奶，充分混勻后，傾注無菌平板， ，待冷卻后，用直徑 4 m m的打孔器在平板上打孔，置 4 1 周內使用。 2 1 :配置方法同上，用5 % b s a 代替無菌全脂牛奶，另加入 1 %吐溫- 8 0 , 2 %菜子油作為脂源。 2 、接種: 待測菌株預先在菜子油培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7 d ，用無菌生理鹽水配制成濃 1 0 - 1 0 / m l 的菌懸液， 用微量加樣器分別滴加 1 5 u 1 于全脂牛奶培養(yǎng) b s a 培養(yǎng)基平板孔內， 用透明 膠帶將平板封閉 ， 以 保持濕度 置 孵箱中 為和育 度基孵 3 、結果測量; 于培養(yǎng)的第1 4 d 取出平板， 1 0 % 的三氯乙酸固定2 小時， 考馬斯藍g 2 5 0 染色過夜， 次日用脫色液充分脫色。 平板背景呈藍色， 如菌株能產生細胞 外蛋白 酶， 則因該酶能分解蛋白 質而使菌落周圍出現透明環(huán)。 測量菌落直 徑與蛋白分解圈的直徑，計算兩者的比值，蛋白酶活性的值以p a 表示: 四川大學碩十 學位論文 討論 ( 一) 近年來在真菌致病物質的研究中， 蛋白酶已被證實與致病性相關: 蛋 白酶能分解角蛋白和膠原蛋白， 使真菌能利用這兩種氮源從而在皮膚及深 部組織中定居、 生長: 此酶還可協助真菌粘附于宿主細胞并且對中性粒細 胞、淋巴 細胞具有趨化活性 r 7 目 前測定真菌蛋白酶活性的方法常用牛奶平板法，原理是在含有葡 萄糖、 酵母粉、 瓊脂的基質中 加入脫脂牛奶作為蛋白 質底物， 觀察蛋白 酶 分解蛋白質所產生的透明圈加以檢測 0 . 5 ) . 本實驗建立的方法能較簡便、 準確地測出 馬拉色菌蛋白 酶的 活性， 并 發(fā)現蛋白酶活性與其致病性相關， 為進一步研究馬拉色菌的致病機理奠定 了基礎。 ( 二) 不同p h值和溫度對蛋白 酶活性有影響，從合計值看， p h 5 . 5 . 3 2 時 蛋白 酶活 性最高。 最適p h 值和溫 度與馬 拉 色菌在 人體 皮膚表 面生活 環(huán)境相近。 蛋白酶抑制劑試驗發(fā)現馬拉色菌的蛋白酶與白念珠菌的酸性蛋 白 酶 不同， 不被天冬氨酸蛋白 酶抑制劑p e p s t a t i n 抑 制 6 3 ， 也 不 被絲 氨酸 蛋白 酶抑制劑p m s f 抑制， 而對金屬蛋白 酶抑制劑e d t a 敏感。 ( 三) 馬拉色菌為嗜脂性酵母菌， 具有脂酶活性， 脂酶能分解三酞甘 油為游離脂肪酸， 給菌體生長提供能量， 脂酶活性升高也有利于馬拉色菌 菌絲相轉化，與致病性相關。本實驗參照 p l o t k i n的方法， 使用對硝基苯 擱酸酷為脂酶特異性底物， 檢測3 3 株糠批馬拉色菌臨床株和2 8 株正常皮 膚分離株的脂酶活性，發(fā)現臨床分離株的 脂酶活性高于正常皮膚分離株 ( r - 6 .9 5 8 p 0 .0 1 ) ， 提示脂酶活性與 致病性相關。 ( 四) 馬拉色菌為條件致病性真菌， 為證實其致病性， 需采用免疫抑制的 小鼠 或大鼠 作實驗動物。 參照 醫(yī) 學實 驗動 物學 和相關 文 獻資 料 1 7 , m 19 . 2 0 ，經多次預實驗，調整免疫抑制方法后，得到采用醋酸潑尼松龍 四川大學碩士學位論文 單次腹腔注射的方法。 需要指出的 是， 對小鼠 進行免疫抑制時使用的 醋酸 潑尼松龍的量， 是以前文獻報道的各種深部真菌病的動物模型中使用的常 規(guī)用量的加倍， 觀察免疫抑制狀態(tài)的指標為體重、 脾臟重量和外周血白細 胞計數。 若體重增加， 脾臟重量未見明顯減輕， 外周血白細胞計數未見下 降，則提示藥量不足，免疫抑制狀態(tài)不理想。腹腔注射醋酸潑尼松龍后， 小鼠 飲水中加入氨節(jié)青霉素( l m g / m l ) ， 以 防 止細菌引起的條件致病感染。 ( 五)動物實驗選擇蛋白 酶活性強 ( p a = o . 2 5 ) 、脂酶活性強 ( 4 4 3 u / m l ) 的菌株:蛋白酶活性弱 ( p a = o . 6 7 ) ，脂酶活性較強 ( 3 6 1 u / m l )的菌株和 無蛋白酶活性 ( p a = l . 0 0 ) ，脂酶活性弱 ( 1 1 6 u / m l )的菌株分別靜脈注射 免疫抑制小鼠，實驗結果顯示蛋白酶、脂酶活性愈強，小鼠死亡率愈高 ( 1 0 0 %) ， 平均生存時間愈短 ( 4 . 1 天) ; 蛋白 酶脂酶活性弱的菌株， 小鼠 死亡率低 ( 6 0 %) ，平均生存時間長 ( 5 . 8天) ;無蛋白酶活性、脂酶活性 最弱的菌株，小鼠死亡率最低 ( 3 0 %) ， 平均生存時間最長 ( 8 .7天) ，表 明蛋白酶、脂酶活性越強，致病性越強，兩者密切相關 ( p 0 .0 1 ) 。 四川大學碩士學位論文 結論 采用生理生化及形態(tài)學方法， 對來源于花斑癬、包皮龜頭炎和腎移 植后腹股溝膿腫患者的皮損區(qū)與非皮損區(qū)的馬拉色菌以及健康人皮膚的 馬拉色菌菌株進行分離鑒定。 共得到3 3 株糠批馬拉色菌、1 2 株合軸馬拉 色菌、 4 株 鈍 形 馬拉 色 菌臨 床 分 離 株 和2 8 株糠 批 馬 拉 色 菌 正 常 皮 膚 分 離 株。 使用全脂牛奶平板法檢測馬拉色菌7 株標準株、 臨床分離株和正常皮 膚分離株的蛋白酶活性， 發(fā)現7 株馬拉色菌標準株均檢出蛋白酶活性， 糠 批馬拉色菌臨床分離株蛋白酶活性高于正常皮膚分離株 ( p 0 . 0 1 ) .蛋白 酶活性受溫度、 p h 值和蛋白 酶抑制劑的影響，發(fā)現蛋白酶活性在3 2 1c , p h 5 .5 時表達最高， e d t a 能抑制蛋白 酶活性。 使用對硝基苯擱酸酷為脂酶 特異性底物檢測3 3 株糠私馬拉色菌臨床株和2 8 株正常皮膚分離株的脂酶 活性， 臨床分離株脂酶活性高于正常皮膚分離株 ( p 0 .0 1). 選擇蛋白 酶、 脂酶活性不同的 3株菌以靜脈內 注射方式感染免疫抑制小鼠 進行毒力實 驗， 以小鼠 死亡率和平均生存時間來評價菌株毒力。 動物試驗結果表明蛋 白酶、脂酶活性愈高的菌株，相應小鼠死亡率愈高，平均生存時間愈短。 提示馬拉色菌的蛋白 酶、 月 旨 酶活性與其致病性相關。 四川大學碩士學位論文 參 考 文 獻 1 .g u i l l o t j , g u e h o e . t h e d i v e r s i t y o f m a l a s s e z i a y e a s t s c o n f i r m e d b y r r n a s e q u e n c e a n d n u c l e a r d n a c o m p a r i s o n s ( j ). a n t o n i e v a n l e e u w e n h o e k , 1 9 9 5 , 6 7 ( 3 ) : 2 9 7 - 3 1 4 . 2 . g u e h o e , b o e k h o u t e , a s h b e e h r , e t a l . t h e r o l e o f m a l a s s e z i a s p e c i e s i n t h e e c o l o g y o f h u m a n s k i n a n d a s p a t h o g e n s ( j ) . m e d i c a l m y c o l o g y , 1 9 9 8 , 3 6 : 2 2 0 3 . h .r u t h a s h b e e , e .g l y n , v . e v a n s . i m m u n o l o g y o f d i s e a s e s a s s o c i a t e d w i t h m a l a s s e z i a s p e c i e s ( j ) .c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y r e v i e w s , 2 0 0 2 , 1 5 , 2 1 - 5 7 . 4. m i t t a g h . m o r p h o l o g y o f m a l a s s e z i a - a s s o c i a t e d d i s e as e s ( j ) . m y c o s e s , 1 9 9 6 ; 3 6 ( s u p p l l ) : 1 3 - 1 9 . 5 . c o u t i n h o s d , p a u l a c r . p r o t e i n as e , p h o s p h o l ip as e , h y a l u r o n i d as e c h o n d r o i t i n - s u l p h a t as e p r o d u c t i o n b y m a l a s s e z i a p a c h y d e r m a t is ( j ) my c o l 2 0 0 0 , 3 8 : 7 3 - 7 6 . 6 . r u c h e l r , d e b e m a r i d i s f , r a y t l , e t a l . c a n d id a a c i d p r o t e i n a s e ( j ) . j me d v e t my c o l , 1 9 9 2 , 3 0 ( s u p p l 1 ) : 1 2 3 - 1 3 3 . 7 . p lo t k i n l 1 , s q u i q u e r a l , m a t h o v i , e t a l . c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e l ip as e a c t i v i t y o f m a la s s e z i a f u rf u r ( j ) . j m e d v e t m y c o l , 1 9 9 6 , 3 4 : 4 3 - 4 8 8 . r a n y , y o s h i k e t , a n d o g a w a h . l i p as e o f m . f u rf u r : s o m e p r o p e r t i e s a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p t o c e l l g r o w t h ,( j ) . j m e d v e t m y c o l , 1 9 9 3 , 3 1 : 7 7 - 8 5 . 9 .冉玉平. 檢測糠批馬拉色菌的幾種取材染色和培養(yǎng)方法介紹 中國皮膚 四川大學碩士學位論文 性病學雜志 ( j ) , 1 9 9 9 , 3 : 1 8 1 - 1 8 2 . 1 0 . g u e h o e , mi d g l e y qg u i l l o t j . t h e g e n u s w i t h d e s c r i p t i o n o f f o u r n e w s p e c i e s ( j ) . a n t o n i e v a n l e e u w e n h o e k , 1 9 9 6 , 6 9 :3 3 7 1 1 . g u i i l o t j , g u o h o e , l e s o u r d m , e t a l . i d e n t i f i c a t i o n o f a a l a s s e z i a s p e c i e s ; a p r a c t i c a l a p p r o a c h ( j ) . j m y c o l m e d ， 1 9 9 6 , 6 ( 2 ) : 1 0 3 - 1 1 0 . 1 2. m a y s e r p , h a z e p , p a p a v a s s i l i s c , e t a l . d i f f e r e n t i o n m a l a s s e z i a c a s t o r o i l r i c i n o l e i c s p p . - s e l e c t i v i t y o f c r e m o p h o r e l , a r i d f o r m . f u r f u r (j) . b r jd e r m a t o l , 1 9 9 7 , 1 3 7 ( 2 ) : 2 0 8 - 2 1 3 . 1 3 . b o e k h o u t t , k a m p m , g u o h o e . m o l e c u l a r t y p i n g o f m a l a s s e z i a s p e c i e s w i t h p e g e a n d r a p d( j). m e d c a l m y c o l o g y , 1 9 9 8 3 6 ( 4 ) : 3 6 5 - 3 7 2 . 1 4 . w e i s s r , r a a b e p , m a y s e r p . y e a s t s o f t h e g e n u s ml as s e z ia : t a x o n o mi c c l as s i f i c a t i o n a n d s i g n i f i c a t i o n in ( v e t e r i n a ry a n d ) c l i n i c a l m e d ic i n e ( j ) . my c o s e s , 2 0 0 0 , ( 4 3 s u p p l 1 ) : 6 9 - 7 2 . 1 5 . r u c h e l r , d e b e rn a r i d i s f , r a y t l , e t a l . c a n d i d a a c i d p r o t e i n a s e ( j ) :j m e d v e t my c o l 1 9 9 2 , 3 0 ( s u p p l l ) : 1 2 3 - 1 3 3 . 1 6 . v a n b e l k u m a , b o e k h o u t t , b o s b o o m r . m o n i t o r i n g s p r e a d o f m a l a s s e z ia i n f e c t i o n i n a n e o n a t a l i n t e n s i v e c a r e u n i t b y p c r - m e d i a t e d g e n e t ic t y p i n g ( j ) . j c l i n mi c r o b i o l 1 9 9 4 , 3 2 : 2 5 2 8 - 2 5 3 2 1 7 . 徐宏彬， 劉維達， 王端禮. 真菌病的免疫抑制動物模型研究進展 j ) . 國 外醫(yī)學皮膚性病學分冊， 1 9 9 6 , 2 2 ( 6 ) : 3 3 7 - 3 4 0 . 3 3 四川大學碩士學位論文 1 8 . 1 版 黃復生. 卡氏肺抱子蟲動物模型. 見魏漢主編. 醫(yī)學實驗動物學 . 第 四川:四川科學技術出版社，1 9 9 8 : 免疫缺陷動物的分類及其特點. 3 7 8 - 3 7 9 . 1 9 .魏亂.見魏亂主編. 醫(yī)學實驗動物 學 第 1 版.四川:四川科學技術出版社，1 9 9 8 : 4 1 2 - 4 1 6 . 2 0 . 趙紅梅. 腎移植患者皮膚膿腫中分離出糠批馬拉色菌的臨床及實驗研 究.四川大學臨床醫(yī)學碩士專業(yè)學位論文.2 0 0 3 . lv om* 9 1 塾塑連一一一一一一一一一一一一 馬拉色菌致病相關因子的研究進展 曾蔚綜述 賈文祥審校 馬拉色菌 ( m a l a s s e z i a ) 是人類和溫血動物皮膚的常駐菌， 亦是一 種條件致病性真菌。 己 有的研究證實它可以引 起花斑癬、 馬拉色菌毛囊炎、 脂溢性皮炎、 異位性皮炎和銀屑病等多種疾病， 可能也與系統性感染有關 12 。 近年 來馬 拉 色菌 致 病 機制 在 侵 襲性 酶、 細 胞 微生 物 學等 方 面 得到了 深入研究，本文在此加以綜述。 1 . 1 侵襲性酶 脂酶活性及其生物學意義 根據形態(tài)學、 e l e c t o p h o r e s i s , 生理生化特性及脈沖凝膠電泳( p u l s e d f i e l d g e l p f g e 和 隨機擴 增 多態(tài) 性 d n a ( r a n d o m p o l y m o r p h i c d n a , r a p d ) 技術的 應用， 馬拉色菌分為7 個種， a m p l i f i e d 分別為厚皮 馬拉色菌 ( m . p a c h d e r m a t i s ) 、 合軸馬拉色菌 ( m . s y m p o d i a l i s ) 、 糠批馬 拉色菌( m . f u r f u r ) 、斯洛菲馬拉色菌( m . s l o o f i a e ) 、鈍形馬拉色菌 恤o b t u s e ) 、 球形馬拉色菌倆g l o b o s e ) 和限 制性馬拉色菌( m . r e s t r i c t a ) 川 。 其中 厚皮 馬 拉色 菌 為 非 嗜 脂 性的 酵母 菌， 其 余6 種 均為 嗜 脂 性 酵 母 菌。 厚皮馬拉色菌的生長雖然可以 不需要脂質， 但培養(yǎng)基中 加入脂質可促進其 生長。 馬拉色菌能利用脂質的特性提示菌體具有能分解脂質的脂酶。 冉玉 平等先以 橄欖油為基 質， 用中 和滴定 法證實 糠批抱子菌具有脂酶活性， 再以a一 棕擱酸為基質， 根據其被分解成。一 蔡酚的量， 用比色法測定糠 四川大學碩十學位論文 我馬拉色菌細胞外液、細胞內可溶性成分和細胞不溶性成分的脂酶活性。 研究證實糠秋馬拉色菌脂酶活性主要存在于細胞不溶性成分中， 活性范圍 p h 4 . 0 - 9 . 0 ，以p h 5 . 0 時最高。同時發(fā)現糠批馬拉色菌的生長速度與脂酶 活 性 呈 相 關 關 系 ， 對 數 生 長 期 脂 酶 活 性 持 續(xù) 上 升 ， 隨 菌 生 長 速 度 減 慢 脂 酶 活性逐漸降低。脂酶的刺激劑牛黃膽酸鹽 ( s t c )可促進脂酶活性，同時 促使糠批抱子菌從酵母相向菌絲相轉化。 而 p l o t o k i n等 石 用對硝基苯桐酸酷 ( p - n i t r o p h e n y l p a l m i t a t e , p n p p )為脂酶特異底物， 測出糠批抱子菌脂酶活性最適值為p h 7 . 5 ， 細胞 可溶性成分、不溶性成分和培養(yǎng)物上清中都可測得脂酶活性。 應用 f p l c ( f a s t p r o t e i n / p e p t i d e / p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) 分析可 溶性分泌物，發(fā)現脂酶活性主要有三個峰，與用s d s - p a g e 法分離蛋白 質 成分取得的結果一致， 提示m . f u r f u r 至少有三種可以 分解脂質底物的脂 酶存在。 p l o t o k i n 等同時也測定了 金屬陽離子對m . f u r f u r 的脂酶活性的 影響， 發(fā)現在n a , k , n h , , c a . ,% m 9 2 % m n ; , b a t , c d r 陽離子中，k 使脂 酶活性明顯增高，c d , 明顯降低脂酶活性，其他陽離子影響作用不明顯。 綜上我們可見，嗜脂性糠批馬拉色菌具有脂酶活性，最高活性范圍 p h 5 . 0 勺 5 , p h 值與馬拉色菌在人和動物皮膚上的生活環(huán)境近似。 脂酶能 分解三酞甘油為游離脂肪酸為