摘要 本文主要包含三部分內(nèi)容，首先是以低溫脫脂豆粕為原料，提取大豆異黃酮糖苷； 其次以大豆分離蛋白乳清廢液為原料，分別以硫酸、c t 淀粉酶、強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂 等為催化劑研究了大豆異黃酮糖苷的水解；最后研究了超臨界c 0 2 萃取法提取異黃酮苷 元的工藝，并以h p l c 對異黃酮苷元進(jìn)行了分離并表征了結(jié)構(gòu)。 以堿性水溶液為溶劑，從低溫脫脂豆粕中提取大豆異黃酮糖苷。由單因素試驗可知： p h 值、提取時間、提取溫度、料液比等對提取結(jié)果具有影響。通過正交試驗優(yōu)化提取 條件為：提取溫度2 5 ，p h1 1 ，料液比1 ：8 ，提取時間2h ，大豆異黃酮糖苷的提取率為 7 7 6 。比較了堿性水溶液提取法、乙醇提取法和超l | 缶界c 0 2 提取法提取大豆異黃酮糖 苷的結(jié)果，結(jié)果表明：堿性水溶液提取法比乙醇提取法的效果稍差，超臨界c 0 2 萃取法 提取率最低。 以大豆分離蛋白乳清廢液為原料，分別以酸、0 t , 淀粉酶、強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂為 催化劑，研究了大豆異黃酮糖苷的水解，結(jié)果表明：在現(xiàn)有試驗條件下酸水解為最佳選 擇。硫酸水解最佳工藝條件：硫酸濃度為2 5m o l l ，水解時間為2h ，水解溫度為8 0 ， 按照最佳條件對結(jié)果進(jìn)行驗證，異黃酮苷元的相對轉(zhuǎn)化率為9 8 7 。硫酸在超聲條件下 和微波條件下水解異黃酮糖苷的能力都很強(qiáng)。 對大豆分離蛋白乳清廢液為原料，水解得到的混合物進(jìn)行超臨界c 0 2 萃取提取異黃 酮苷元研究，試驗結(jié)果表明：以7 0 的乙醇為夾帶劑，夾帶劑用量為8 ；萃取壓力為 3 0m p a ；萃取溫度為6 0 ；萃取時間為1 2 0r a i n ；在此條件下，異黃酮苷元的提取率為 7 9 2 。 采用h p l c 技術(shù)對超臨界c 0 2 提取物進(jìn)行單體分離，以u v 、i r 、h p l c 、e s i m s 對產(chǎn)品進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。 關(guān)鍵詞：分離蛋白乳清液；異黃酮苷元；水解；超臨界c 0 2 提取 a b s t r a c t t h e r ea r em a i n l yt h r e ep a r t so fc o n t e n t si nt h i st h e s i s f i r s t l y , t h ei s o f l a v o n eg l y c o s i d e s w e r ee x t r a c t e df r o md e f a t t e ds o yf l a k e sa n ds p im i l ks e r u m s e c o n d l y ，t h ei s o f l a v o n e g l y c o s i d e sw e r eh y d r o l y z e db ym e a n so f d i f f e r e n tc a t a l y s ts u c ha sa c i d a a m y l a s ea n ds t r o n g a c i d i cc a t i o n i c e x c h a n g e dr e s i ne t c t h i r d l y , t h ei s o f l a v o n eg l y c o s i d e sh y d r o l y z e df r o ms p i m i l l 【s e r l l n lw e r ei s o l a t e db ys f e - c 0 2e x t r a c t i o na n dp u r i f i e db yh p l c t h es o y b e a ni s o f l a v o n eg l y c o s i d e sw e r ee x t r a c t e db yb a s i cs o l v e n tf r o md e f a a e ds o y f l a k e s i th a sb e e nl e a r n e dt h a te x t r a c t i o nr e s u l t sw e r ee t f e c t e db yp hv a l u e ，t i m e ，t e m p e r a t u r e a n dt h er a t i oo fm a t e r i a lt os o l v e n tw e r ee f f e c t i v ec o n d i t i o n s t h eo p t i u me x t r a c t i o n c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e db ys i n g l ef a c t o rt e s t sa n d o r t h o g o n a lt e s t s ，t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s c o n f m n e da sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e2 5 ，p h1 1 ，t h er a t i oo f m a t e r i a lt os o l v e n t1 ：8 ，t i m e2 h o u r sa n dt h ee x t r a c t i o nr a t eo f s o y b e a ni s o f l a v o n eg l y c o s i d e sw a s7 7 6 u n d e rt h i sc o n d i t i o n n l i sm e t h o dw a sc o m p a r e dw i t he t h a n o le x t r a c t i o nm e t h o da n ds u p e r e r i t i c a lf l u i d se x t r a c t i o n m e t h o d 1 1 ”e x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a te t h a n o le x t r a c t i o nm e t h o dw a st h eb e s ta n d t h ee x t r a c t i o nm e t h o du n d e rb a s i cs o l v e n tw a sb e t t e rt h a nt h es u p e r c r i t i c a lf l u i d se x t r a c t i o n m e t h o d t h es o y b e a ni s o f l a v o n eg l y c o s i d e se x t r a c t e df r o mt h es p im i l ks e r u mw e r eh y d r o l y z e d b yd i f f e r e n tc a t a l y s t ss u c ha sa c i d a - a m y l a s ea n ds t r o n ga c i d i cc a t i o n i c - e x c h a n g e dr e s i ne t c h y d r o l y 7 s i se f f i c i e n c yw a ss t u d i e dt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e ma n di ti n d i c a t e dt h a ta c i d h y d r o l y s i sw a st h eb e s tc h o i c eu n d e rp r e s e n te x p e r i m e n tc o n d i t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s o fs u l f u r i ca c i dh y d r d y s i sw e r ec o n f i r m e da sf o l l o w ：t h ec o n c e n t r a t i o no fs u l f u r i ca c i d2 5 m o l l ，t h er e a c t i o nt i m e2ha n dt h er e a c t i o nt e m p e r a t u r e8 0 ，t h er e l a t i v et r a n s l a t i o nr a t i o o fi s o f l a v o n ea g l y c o n e sc o n f i r m e du n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw a s9 8 7 b yt h ew a y , t h e a c i dh y d r o l y s i sm e t h o d w a sc o m p a r e dw i t hu l t r a s o u n dh y d r o l y s i sa n dm i c r o w a v eh y d r o l y s i s 1 1 1 ch y d r o l y s a t ef r o mt h es p im i 墩n l mw a se x t r a c e db ys f e c 0 2e x t r a c t i o n n e e x l m i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep e r f e c te x t r a c t i o nr a t i oo fi s o f l a v o n ea g l y e o n e sw a s 7 9 2 w h i c hw a so b t a i n e du n d e rt h ee x t r a c t i o np r e s s u r eo f3 0m p a , t h ee x t r a c t i o n t e m p e r a t u r eo f6 0 t h ee x t r a c t i o nt i m eo f1 2 0m i na n dw i t h7 0 e t h a n o la se n t r a i n m e n t r e a g e n ta tt h ep e r c e n t a g eo f8 r e f e r e n c e dt oc 0 2a m o u n t f i n a l l y ，t h ee x t r a c t i v ew a sp u r i f i e db yh p l ca n dt h ei s o f l a v o n ea g l y c o n e sm o s t a b u n d a n ti ne x t r a c t i v ew e r ec o n f i r m e da sd a i d z e i na n dg e n i s t e i n , w h i c hw e r ec h a r a c t e r i z e d b yu v 、i r 、h p l ca n de s i m s k e y w o r d s ：s p im i l ks e r u m ；i s o f l a v o n ea g l y c o n e s ；h y d r o l y s i s ；s u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o n 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及 取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外， 論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得河 南工業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工 作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表 示了謝意。 論文作者簽名：歪叁日期切口7 r 優(yōu) 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解河南工業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；本 人授權(quán)河南工業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù) 據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編 學(xué)位論文。( 保密的論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定) 論文作者簽名： 致一日期：竺! ：蘭 導(dǎo)師簽名：噬日期：絲! 聾亞固 豆粕和分離蛋白乳清廢液中異黃酮的提取與分離 i i 立題的目的和意義 第一章前言 大豆異黃酮是大豆次生代謝產(chǎn)物，是近年來食品與營養(yǎng)學(xué)研究的熱點之一。我國是 大豆的故鄉(xiāng)，大豆資源十分豐富。目前我國大豆加工業(yè)主要以加工油脂產(chǎn)品為主。對 大豆異黃酮等活性有效物質(zhì)的提取，大豆資源綜合開發(fā)利用的研究是近幾年來研究的 熱點。據(jù)有人估算【l 】，對大豆生物活性成分進(jìn)行開發(fā)利用，可以極大地提高大豆的附 加值，投入產(chǎn)出比將高達(dá)i ：5 5 以上。大豆異黃酮具有改善婦女更年期綜合癥、防治 骨質(zhì)疏松、預(yù)防心血管病、抗氧化性、抗菌等多種生理功能，可廣泛應(yīng)用于藥品和保健 食品中。 目前，大豆異黃酮提取工藝主要是以豆粕為原料，利用乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。 該工藝存在產(chǎn)品純度低、生產(chǎn)成本高等問題。超臨界c 0 2 萃取技術(shù)是一種環(huán)境友好的 提取方法，是當(dāng)前分離技術(shù)新的發(fā)展方向，特別適用于天然產(chǎn)物中生理活性物質(zhì)的提取 與分離，在化工、食品、中藥等研究領(lǐng)域已引起廣泛的關(guān)注。如果能研究出一種以超臨 界c 0 2 萃取技術(shù)為主的提取方法，可以為異黃酮的提取提供一條對環(huán)境友好的工藝路 線。 異黃酮的結(jié)構(gòu)是以色原酮為主體的多元酚，是弱酸性化合物，在堿性水溶液中是 以離子狀態(tài)存在的，所以在堿性條件下其具有極好的水溶性，以此為出發(fā)點，可以考 慮研究以堿性水溶液為溶劑的提取異黃酮。 醇法制備濃縮蛋白和堿提酸沉法生產(chǎn)分離蛋白，是目前生產(chǎn)植物蛋白的方法。在 分離蛋白的生產(chǎn)過程中，會產(chǎn)生大量的分離蛋白乳清廢液，目前，這些乳清液僅是經(jīng) 過簡單處理后直接排放到環(huán)境中去，這樣不但會造成水體富營養(yǎng)污染問題，而且對分 離蛋白乳清液中具有高附加值的生物活性成分( 如大豆異黃酮等) 沒有充分利用。如 果能將這部分異黃酮進(jìn)行回收，不僅可以增加大豆產(chǎn)品的附加值，而且對污水的治理 有一定的作用，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。 1 2 大豆異黃酮的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與生理功能 異黃酮是黃酮類化合物的一類，與黃酮類化合物的廣泛分布不同，異黃酮的分布范 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 圍很窄，主要分布于豆科植物p a p i l i o n o i d e a e 亞科的一些屬中1 2 1 。其中含量較高的有苜 蓿、紅三葉草和大豆，一般苜蓿中異黃酮的含量為o 5 0 o - - 3 5 紅三葉草中異黃酮含量 為1 5 - u 2 5 ，大豆中異黃酮的含量為o 1 - - 0 5 蚶”。大豆異黃酮主要分布于大豆種子 的子葉和胚芽中，種皮中含量極少。微生物發(fā)酵液中的異黃酮都來自培養(yǎng)基中的豆粕。 人體攝入的異黃酮幾乎全部來自大豆及豆類食物【4 j 。大豆異黃酮含量的種間差異很大， 也受種植時間、氣候等因素的影響1 5 】，不同的大豆食品中異黃酮主要存在形式和含量 差異很大t 6 - s 】。由于這類化合物與雌二醇的結(jié)構(gòu)相似，所以在人們體內(nèi)具有微弱的雌 激素活性，合稱為異黃酮植物雌激素【9 】。 早在1 9 3 0 年人們就發(fā)現(xiàn)在大豆中存在異黃酮，它是豆制品苦澀味的主要來源，對 動物有雌激素作用，長期以來被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子 1 0 , 1 1 】。1 9 8 2 年以前沒有異黃酮 對人體作用的任何研究報道，在九十年代對大豆異黃酮的生理與營養(yǎng)作用的研究和重新 評價成為世界性的熱劇1 2 】。1 9 8 6 年，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大豆中抑制癌細(xì)胞的異黃酮。1 9 9 0 年6 月，美國國家癌癥研究院組織全美著名學(xué)者研討了大豆的抗癌效果，肯定大豆異 黃酮是其最佳的天然物質(zhì)。此后又證實大豆異黃酮可以防止骨質(zhì)疏松癥、減輕婦女更 年期不適癥及降低冠心病的發(fā)病率。1 9 9 8 年美國食品及藥物管理局正式批準(zhǔn)大豆為 健康食品。1 9 9 8 年w a k ef o r e s t 大學(xué)的b a p t i s t 醫(yī)學(xué)中心發(fā)表報告指出大豆中防癌抗 癌和降低膽固醇的關(guān)鍵物質(zhì)是大豆異黃酮，并非蛋白質(zhì)。在過去幾年中，約有1 0 0 0 多項研究結(jié)果發(fā)表，闡述異黃酮對人體的健康益處。 1 9 9 5 年1 1 月，世界上第一個以大豆異黃酮為主要原料的功能性食品在芬蘭市場 上出現(xiàn)。次年，美國f d a 批準(zhǔn)大豆異黃酮作為健康食品上市。美國a d m 公司在1 9 9 9 年開始建設(shè)世界上第一家大豆異黃酮生產(chǎn)廠，1 9 9 9 年正式生產(chǎn)純度為4 0 的大豆異 黃酮產(chǎn)品p h y t o n u t r i e n t s t m 。美國中央大豆公司的主要產(chǎn)品為強(qiáng)化大豆異黃酮的大豆 蛋白制品，應(yīng)用于促進(jìn)健康的日常飲食補(bǔ)充物和功能性食品中。s o y h e a l t h 和s c h o u t e n 公司的主要產(chǎn)品為大豆胚芽與胚芽提取物( i s o l i f e ) 。在日本已有商品“大豆胚芽 茶y4t 夕 以及7 礦7 于水二，等出售，主要是一些用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、調(diào)節(jié) 骨代謝等保健食品。 目前，國內(nèi)開發(fā)異黃酮主要作為食品、保健品、特別是醫(yī)藥中間體和藥物組分。 生產(chǎn)異黃酮產(chǎn)品純度低，一般都在4 0 左右，并且生產(chǎn)成本高，工藝復(fù)雜，因此有必 要系統(tǒng)地研究節(jié)能、高效的提取方法。 2 豆粕和分離蛋白乳清廢液中異黃酮的提取與分離 1 2 1 大豆異黃酮的結(jié)構(gòu)和分布 天然存在的大豆異黃酮主要有1 2 種，分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷，其結(jié)構(gòu)見 圖1 - 1 和表1 1 。 o h 大豆苷元：r 1 = h ，r 2 = h 異黃酮葡糖苷：r 3 = h 染料木素：r 1 _ h ，r 2 = o h 異黃酮乙?；咸擒眨簉 3 = c o c h 3 黃豆黃素：r | 1 = o c h 3 ，r 2 = h 異黃酮丙二?；咸擒眨簉 3 = c o c h 2 c o o h 圖i - 1 大豆異黃酮的結(jié)構(gòu) 大豆異黃酮的三種苷元分別是大豆苷元( d a i d z e i n ) ，染料木素( g e n i s t e i n ) 和黃豆 黃素( g l y c i t e i n ) b 3 。在大豆籽粒中只有少量異黃酮以游離形式存在。占總量的2 3 ， 9 7 9 8 的異黃酮以各種糖營形式存在，其中6 0 7 0 是丙二?；漠慄S酮糖苷【1 4 1 。 表1 - 1 大豆異黃酮 盔星墨重旦 墾! d a i d z e i nhh g e n i s t e i no hh g l y c i t e i n h - 0 c h 3 一 d a i d z i n hhh g e n i s t i no hhh g l y e i t i n - h - o c h 3 h 6 一o a c e t y l d a i d z i n hh c o c h 3 6 o a c e t y l g e n i s t i n - o hh - c o c h 3 6 。一0 - a c e t y l g l y c i t i n - i - i o c h 3 一c o c h 3 6 - o - m a l o n y l d a i d z i n - hh - c o c h 2 c o o h 6 - o m a l o n y l g e n i s t i n - o h- h c o c h 2 c o o h ! ：q ：m ! ! ! 璺z ! g ! z ! i ! i 望：旦：q 出：g q 旦2 竺q q 旦 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 大豆籽粒的異黃酮含量受大豆品種、產(chǎn)地、生產(chǎn)年份的影響，其變化范圍約為 o 0 5 0 7 。大豆胚軸( 包括胚根和胚芽) 中異黃酮含量約為子葉的6 倍，在大豆 胚芽中異黃酮含量為1 4 , - 1 7 6 ，種皮中含量很少。但由于子葉占大豆籽粒重的9 5 以上。因此大豆子葉中異黃酮的絕對含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于胚軸n 5 1 。大豆各部位的異黃酮含 量見表1 2 t 1 6 1 。 名稱大豆苷染料木營大豆苷元染料木素總量 大豆籽粒中約5 0 - 6 0 的異黃酮苷元為染料木素( g e n i s t e i n ) ，約3 0 - - 3 5 的異 黃酮苷元為大豆苷元( d a i d z e i n ) ，約5 1 5 的異黃酮苷元為黃豆黃素( g l y c i t e i n ) 。在 大豆加工中，不同的異黃酮流失程度不同，因此大豆產(chǎn)品中各種異黃酮所占比例與未 加工的大豆有所不同。除個別產(chǎn)品外，大多數(shù)大豆食品中，染料木素含量最高，其次 是大豆苷元，黃豆黃素的含量相當(dāng)少。 t 2 2 大豆異黃酮的理化性質(zhì) 純大豆異黃酮是無色的晶體物質(zhì)，染料木素( g e n i s t e i n ) 為無色片狀結(jié)晶，大豆苷元 ( d a i d z e i n ) 為無色針狀結(jié)晶，工業(yè)上的大豆異黃酮產(chǎn)品為白色或淡黃色粉末【1 7 1 。大豆異 黃酮具有苦味、收斂性和于澀感覺，是產(chǎn)生大豆苦澀味的因子之一，其中苷元比糖苷具 有更強(qiáng)的不愉快風(fēng)味，但同時也受到加工條件的影響。 大豆異黃酮是一種弱酚酸，易溶于堿性溶液以及丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等 極性溶劑中。紫外燈下多為顯紫色。異黃酮苷元不具有旋光性，但對于染料木苷和大豆 苷而言，由于結(jié)構(gòu)中引入了糖基，因而具有旋光性【i ”。 游離型的大豆異黃酮基本不溶于水；糖苷一般易溶于水，但染料木苷( g e n i s t i n ) 除外，其溶解度在4 5 0 之間沒有明顯變化，在7 0 9 0 之間其溶解度隨著溫度的 升高而顯著增加。因此，在用水溶液提取大豆異黃酮時，溫度應(yīng)超過7 0 1 1 6 】。 丙二酰糖苷熱不穩(wěn)定，以極性溶劑熱浸時( 高于8 0 ) 迅速脫去丙二酰基得到 4 豆柏和分離蛋白乳清廢液中異黃酮的提取與分離 相應(yīng)的糖苷 1 5 】；丙二?；擒崭蔁崽幚頃r發(fā)生脫羧反應(yīng)得到天然大豆中不存在的乙 酰化糖苷【1 9 1 。大豆異黃酮中的丙二?；擒赵诩訜岷蛪A性條件下可以水解去掉丙二 酰基和乙?；D(zhuǎn)化成相應(yīng)的葡萄糖苷。堿水解條件p h 值為8 1 3 ，水解程度隨p h 值及溫度的升高而加大。各種異黃酮葡糖苷在發(fā)酵過程中可被o 【葡萄糖苷酶水解為游 離的苷元，苷元的結(jié)構(gòu)也可能被分解或改變。大豆異黃酮中的葡萄糖苷在強(qiáng)酸或酶存 在時可水解去掉葡萄糖基而轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元。異黃酮苷元在加熱和酸水解過程中非 常穩(wěn)定，1 0 0 加熱3 h 和4 m h c l 中1 0 0 水解3h ，僅損失1 也 2 0 1 。 1 2 3 大豆異黃酮的生理功能 大豆異黃酮能與雌激素受體結(jié)合，并產(chǎn)生弱的雌激素效應(yīng)，這種弱的雌激素作用 在一定濃度下會表現(xiàn)出抗雌激素活性，這種生物效應(yīng)主要體現(xiàn)在與激素相關(guān)的疾病 上。藥理學(xué)研究表明【2 1 】：大豆異黃酮可作為雌性激素治療藥物的替代品，可改善婦 女更年期綜合癥，并具有降低血液膽固醇、防止骨質(zhì)疏松及抑制癌細(xì)胞生長的作用。 國外流行病因?qū)W證明1 2 2 1 ，東方人的乳腺癌、結(jié)腸癌和大腸癌的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方人， 其重要原因是東方人的食物( 主要是大豆中) 含有大量的植物雌激素，經(jīng)考證大豆異 黃酮成分是引起癌癥患病率下降的主要因素之一。 研究表n t 2 3 1 ，大豆苷元( d a i d z e i n ) 具有降低血液膽固醇、抑制血小板凝聚、阻 止平滑肌細(xì)胞增值的作用，使用異黃酮還能有效地防止頭發(fā)損失、保護(hù)頭發(fā)組織的完 整性，并已開發(fā)出產(chǎn)品，作為頭發(fā)外用藥水，其中含有半純化的大豆提取物( 含2 0 5 0 的異黃酮) 。 m i c h a e ln a i m 等【2 4 】人研究了大豆異黃酮對真菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)濃度為o 0 0 5 的游離異黃酮顯示出了重要的抗菌活性。 1 3 大豆異黃酮的提取分離方法 1 3 1 有機(jī)溶劑提取法 有機(jī)溶劑提取法是國內(nèi)外提取異黃酮使用最廣泛的方法，常用的有機(jī)溶劑主要有： 乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等口5 】。異黃酮糖苷的特殊分子結(jié)構(gòu)，決定了其較大的分子 極性，根據(jù)相似相溶的原理，異黃酮可以被這些極性溶劑溶出，進(jìn)入溶液相，為下一步 的純化處理提供了條件。 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 有機(jī)溶劑提取方法存在溶劑消耗量大、生產(chǎn)成本高、異黃酮得率和含量低、雜質(zhì)多 及溶劑殘留等問題。所以，其它提取技術(shù)的研究受到愈來愈多的關(guān)注。 1 3 2 超臨界流體萃取技術(shù)( s f e ) 超臨界流體萃取是上世紀(jì)8 0 年代發(fā)展起來的一項新提取分離技術(shù)，該技術(shù)是以超臨 界流體為提取劑，從液體或固體中提取出待測組分。 超臨界流體( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，s c f ) 是物質(zhì)介于氣體和液體之間的一種特殊的聚集 狀態(tài)，在超臨界狀態(tài)下，流體具有氣體和液體的雙重特性，即具有氣體的高擴(kuò)散性和高 滲透性、低粘度的特點，又兼有與液體相近的密度和溶解度。正是這種雙重特性使得超 臨界流體對物料有良好的滲透性和較強(qiáng)的溶解能力。超臨界流體萃取技術(shù)是利用臨界或 超臨界狀態(tài)的流體及被萃取的物質(zhì)在不同的蒸汽壓力下所具有的不同化學(xué)親和力和溶 解能力進(jìn)行分離純化的操作。利用流體在臨界點附近，體系溫度和壓力的微小變化，使 物質(zhì)溶解度發(fā)生幾個數(shù)量級的突變特性來實現(xiàn)其對物質(zhì)的提取分離。通過改變壓力或溫 度來改變超臨界流體的性質(zhì)，達(dá)到選擇性地提取各種類型化合物的日的1 2 6 , 2 習(xí)。 能用于超臨界流體的物質(zhì)很多，如c 0 2 、h 2 0 、c z h 4 、c 3 h s 、c h 3 0 h 、n 0 2 等， 其中c 0 2 氣體在超臨界萃取工業(yè)的應(yīng)用最為廣泛口”。c 0 2 價廉、易得，且不易燃、不易 爆是一種安全性較高的氣體。其臨界條件易達(dá)至1 t ( t c = 3 9 4 1 kp c = 7 3 4 7 m p a ) ，可在常溫 下操作，有效地防止熱敏性和化學(xué)不穩(wěn)定性成分的高溫破壞和氧化，不影響萃取物的生 理活性；無色無味無毒，萃取物無溶劑殘留，對環(huán)境沒有污染，是一種環(huán)境友好的可持 續(xù)發(fā)展的綠色環(huán)保技術(shù)；從提取到分離一步完成，操作費用低；選擇性好，通過調(diào)節(jié)溫 度和壓力，可有針對性地提取出有效成分等特點【2 。兀。故超臨界c 0 2 萃取技術(shù)在天然產(chǎn)物 有效成分的提取中應(yīng)用廣泛，特別是對一些含量低、附加值高的產(chǎn)品極為適用。隨著超 臨界c 0 2 萃取技術(shù)的不斷進(jìn)步，全氟聚醚碳酸銨( p e p e ) 的應(yīng)用，把超臨界c 0 2 萃取擴(kuò) 展到水溶液體系范圍，使得難以提取的強(qiáng)極性化合物如蛋白質(zhì)等的超臨界c 0 2 提取已成 為可能圓。 1 3 3 酶工程技術(shù)皿e ) 酶工程技術(shù)是指在異黃酮提取過程中，通過加入恰當(dāng)?shù)拿赴l(fā)生轉(zhuǎn)糖反應(yīng)和酶解反應(yīng) 而使產(chǎn)品中異黃酮得率和含量大大提高的新興技術(shù) 2 9 1 。若只用水( 或醇水) 提取，只能提 取以糖苷為主要成分的水溶性異黃酮糖苷，油溶性的異黃酮苷元就很難提取出，致使傳 統(tǒng)提取方法中異黃酮苷元得率和含量過低。此時如果加入恰當(dāng)?shù)拿?，不僅可以將油溶性 6 豆粕和分離蛋白乳清廢液中異黃酮的提取與分離 的異黃酮轉(zhuǎn)化為易溶于水的糖苷而有利于提?。欢疫€可通過酶反應(yīng)將植物組織分解， 使提取傳質(zhì)阻力減小，加速異黃酮的釋放，提高提取效率；另外也可使提取液中的淀粉、 蛋白質(zhì)、果膠等分解，從而簡化后續(xù)分離純化工序。因此在傳統(tǒng)異黃酮提取工藝占主導(dǎo) 的工業(yè)化生產(chǎn)中具有良好的工業(yè)可行性，并具有提取條件溫和有利干異黃酮活性護(hù)、成 本低、安全等優(yōu)點。另外，該技術(shù)對干燥或浸濕的原料皆適用。 1 3 4 物理場輔助提取技術(shù)( s e m e ) 物理場輔助提取技術(shù)，是指通過引入恰當(dāng)?shù)奈锢韴鲚o助異黃酮提取而使異黃酮得率 和含量大大提高的新興技術(shù)。一般又分為超聲場輔助提取技術(shù)和微波場輔助提取技術(shù)。 超聲場輔助提取技術(shù)主要是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、高加速度、空化效應(yīng)、攪 拌作用等，從整體上能提高提取過程的傳質(zhì)速率和效果，可加速植物材料中的有效成分 進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時間，并且還可避免高溫對提取成分 的影響【3 0 】。超聲法提取異黃酮活性成分具有省時、節(jié)能、提取率和產(chǎn)品純度高的優(yōu)點。 謝明杰等 3 h 利用超聲波從脫脂豆粕中提取大豆異黃酮一次，提取時間3 0m i l l ，所得大豆 異黃酮的提取率比加熱回流提取1 2 0m i n 提取率高約4 6 ，與加熱回流提取兩次，2 4 0m i n 的提取率一致。賀云等【3 2 】采用超聲法從野葛根中提取葛根異黃酮，再將提取物水解，經(jīng) 分離純化得到大豆苷元，得率為0 5 ，純度為9 8 2 。 微波場對異黃酮提取的輔助作用主要來源于微波對細(xì)胞膜的生物效應(yīng)口3 1 ，使細(xì)胞內(nèi) 部溫度升高，壓力增大，當(dāng)壓力超過細(xì)胞壁的承受能力時，細(xì)胞壁破裂，異黃酮從細(xì)胞 中釋放出來，傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍，其熱量傳遞和質(zhì)量傳遞的方向是一致的，這有助于 異黃酮的快速溶出。微波場輔助提取技術(shù)同樣具有選擇性高、提取時間短、溶劑用量少、 后處理方便、能耗較低等優(yōu)點。張永忠等【3 4 1 利用微波對原料低溫脫脂豆粕進(jìn)行前處理， 提高了大豆異黃酮的溶出率，并提高操作的選擇性。賈建波等【3 5 】將大豆胚芽進(jìn)行微波前 處理，經(jīng)4 5 0w 微波處理3 0r a i n ，異黃酮提取率從1 2 提高到i 7 4 ，比溶劑法的提取率 提高了4 3 。 1 3 5 超濾技術(shù)( o f ) 超濾技術(shù)是指常溫下以一定壓力和流量，利用不對稱微孔結(jié)構(gòu)和半透膜分離介質(zhì)， 以錯流方式進(jìn)行過濾，使溶劑及小分子物質(zhì)通過，高分子物質(zhì)和微粒子如蛋白質(zhì)、水溶 性聚合物、細(xì)菌等被濾膜阻留，從而達(dá)到分離、純化、濃縮的新型膜分離技術(shù)3 6 1 。該技 術(shù)用于異黃酮的分離純化時，與傳統(tǒng)的分離方法相比，具有分離效率高、分離速度快、 7 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 分離過程無相變、不易形成表面極化現(xiàn)象、無污染、無須加熱且超濾膜可反復(fù)使用的特 點。馮建光，谷文英【3 可，選用孔徑為1 2p m 的無機(jī)膜，操作壓力為o 1 2 5m p a ，料液操 作溫度為8 0 ，澄清過程中用3 倍體積的水分批對濃縮液進(jìn)行稀釋，大豆異黃酮的保留 率最佳。 t 3 6 高速逆流色譜提取技術(shù)( h s c c c l 高速逆流色譜技術(shù)是一種不用于任何載體或支撐體的液液分配色譜技術(shù)，由美國醫(yī) 學(xué)院y i o c h i r o l t o 博士于2 0 世紀(jì)6 0 年代末首創(chuàng)，該技術(shù)建立在單向勝流體動力平衡體系之 上，利用相對移動的互不混溶的兩相溶劑，在處于動態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比 的樣品組分分離【3 樸。目前，已成功地開發(fā)出分析型和制備型高速逆流色譜儀。h s c c c 既可用于異黃酮的制備分離，又可定量，迸樣量可從毫克級到克級。該技術(shù)用于異黃酮 的分離純化時，具有分辨率高、分離速度快、分離純化同步完成、產(chǎn)品純度高、不存在 載體對異黃酮的吸附和污染、制備量大和溶劑消耗量少等特點。江和源等【3 9 】采用高速逆 流色譜法分離純化大豆異黃酮中的大豆苷和染料木苷，溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯一醋酸一水， 體積比為5 ：l ：1 0 ，上相為固定相，下相為流動相，逆流色譜儀轉(zhuǎn)速為8 0 0r m i n ，流速為 1 5m l m i n 所得大豆苷、染料木苷經(jīng)高效液相色譜分析測定，純度分別達(dá)到9 8 2 和 9 9 2 。 1 3 7 高速離心分離技術(shù)( h s c l 高速離心分離技術(shù)是以離心機(jī)為主要設(shè)備，通過離心杌的高速運轉(zhuǎn)，增加沉降速度， 使溶液中的雜質(zhì)加速沉淀的一種方法【帥1 。目前使用的離心機(jī)有：沉降式離心機(jī)、蝶片式 離心機(jī)、過濾式離心機(jī)，其中沉降式離心機(jī)因具有操作方便、維修簡單、沉淀量多少不 限等特點應(yīng)用最為廣泛。該技術(shù)用于異黃酮的分離純化時，與傳統(tǒng)的醇沉法相比具有省 時省力、工藝流程短、成本低廉、容易實現(xiàn)工業(yè)化等特點，且由于是物理分離純化，不 會引起提取液中異黃酮發(fā)生變化或損失，最大限度地保存了異黃酮的活性成分。 t 3 8 超高壓提取技術(shù)( uh p e ) 超高壓提取又稱超高冷等靜壓提取，它是在常溫下用1 0 0 1 0 0 0m p a 的液體靜壓力 作用于藥液上，使提取溶劑滲透到藥物細(xì)胞內(nèi)，在預(yù)定壓力下保持一段時間使有效成分 達(dá)到溶解平衡后迅速卸壓，由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓力差突然增大，細(xì)胞內(nèi)的有效成分轉(zhuǎn)移 3 豆粕和分離蛋白乳清廢液中異黃酮的提取與分離 到細(xì)胞外的提取。與傳統(tǒng)的煎煮、回流提取等方法相比，超高壓提取在縮短提取時間、 降低能耗、減少雜質(zhì)成分溶出的同時，提高了有效成分的收率。超高壓提取是在常溫下 進(jìn)行的，因此避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性降低，同時 由于超高壓提取是在密閉環(huán)境下進(jìn)行的，沒有溶劑揮發(fā)，不會對環(huán)境造成污染，因此該 技術(shù)更加符合“綠色”環(huán)保的要求【4 l 】。超高壓生物加工技術(shù)在食品滅菌、病毒滅活、疫 苗制取、蛋白質(zhì)改性、生化制藥等多方面都有很好的應(yīng)用。 1 4 大豆異黃酮糖苷的水解方法 1 4 1 大豆異黃酮糖苷的酸水解 異黃酮糖苷能被酸催化水解，多采用較濃的鹽酸或硫酸( 1 3t o o l l ) ，較高的溫度 ( 8 0 - - - 1 0 0 ) 。糖苷鍵首先發(fā)生質(zhì)子化，然后糖苷鍵斷裂生成菅元和碳水化合物。 1 4 2 大豆異黃酮糖苷的s m i t h 降解 該法是一種氧化開裂法，比酸水解溫和，能完整地保持苷元的結(jié)構(gòu)。第一步用n a l 0 4 將糖的二羥基氧化開裂為二元醛結(jié)構(gòu)，第二步用n a b h 4 將二元醛結(jié)構(gòu)還原成二元醇結(jié) 構(gòu)，第三步在室溫條件下與酸作用使其水解。 1 4 3 大豆異黃酮糖苷的酶水解 酶水解條件溫和，多采用弱酸性的緩沖溶液，大豆異黃酮苷元不易變性，是工業(yè)上 制備富含大豆異黃酮苷元保健食品的很有前途的途徑。酶的專一性很強(qiáng)，目前研究較多 的大豆異黃酮糖昔水解酶就是p 葡萄糖苷酶，大豆自身含有的內(nèi)源p 葡萄糖苷酶水解活 性不強(qiáng)，水解效率只有2 2 2 9 。添加足量的高活性酶( 如乳酸菌中提取的b 葡萄糖 苷酶) 可使水解達(dá)到8 0 以上。能夠水解大豆異黃酮糖苷的酶還有葡萄糖酸酶、a 半乳 糖苷酶、生物乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶f 等，它們都有很強(qiáng)的水解大豆異黃酮糖苷 的能力【4 2 1 。 9 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 5 大豆異黃酮含量的測定 大豆異黃酮含量測定的方法非常多，文獻(xiàn)報道較多的主要有紫外分光光度法和色 譜法。其中紫外分光光度法【4 3 】是基于大豆異黃酮在紫外區(qū)有特征吸收，且各個苷元和 糖苷的最大吸收波長相差不大而進(jìn)行測定的，該法簡便易行，穩(wěn)定可靠，應(yīng)用較廣， 但是特異性差，不適用于嚴(yán)格定量計算，適用于快速分析及一般中小企業(yè)采用。j i a n t o h e 等【4 4 】采用大孔樹脂法吸附純化樣品，測定大豆異黃酮含量，其中總異黃酮含量以 染料木素計算為3 8 7 ，平均加樣回收率為9 9 8 6 ，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2 6 。 色譜法有高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜( g c m s ) 法、液相色譜質(zhì)譜( i - i p l c m s ) 法，其中高效液相色譜是應(yīng)用范圍最為廣泛的分離和定量測定異黃酮的方法，具有分 離效率高，分辨率好，靈敏度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確等特點，適合用于某具體黃酮類化合 物的測定。 徐健英，鄒穎秀【4 5 】采用色譜柱c 1 8 反相柱( 3 9m m x l 5 0m mw a t e r s 公司) 、流動相 為乙腈0 0 0 3m n a 2 h p 0 4 ( 1 7 ：8 3 ) ，迸樣量l o h l ，流速1 0 m l m i n ，柱溫3 5 ，檢測 波長2 6 0 n m ，結(jié)果表明，異黃酮的平均回收率為9 8 1 5 ，精密度為0 5 4 4 。 鞠興榮等 4 6 1 將樣品水解后，采用n o v a p a k c l 8 反相色譜柱( 3 9 m m x l 5 0 m m ) ，在 進(jìn)樣量為4t t m ，流動相為m e o h o ，4 h 3 p 0 4 ( 4 7 ：5 3v v ) ，流速o 7m l m i n ，檢測波 長2 6 0n n l ，柱溫2 5 的色譜條件下測定苷元含量，重現(xiàn)性好，回收率達(dá)9 9 ，變異 系數(shù)小于3 。 孫君明等【4 將樣品用離心機(jī)離心后，采用h i c h r o m3 1 6 a l o f t ( u k ) c 1 8 色譜柱 ( 1 5 0m m x 4 0m m ) ，流動相含5 ( v v ) 的甲醇水溶液，流量為1m l m i n ，檢測波 長2 5 4n n l ，柱溫5 0 ，進(jìn)樣量1 0 皿，分析時間2 0 - 4 0m i n 樣品。 氣相色譜法具有低檢測限、高效能、高選擇性等突出優(yōu)點，但是由于在測定黃豆 苷和染料木苷時需要制備衍生物，制備步驟較多，耗時長，難以推廣。j o a n n o ug e 等【4 8 】采用毛細(xì)管氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用分離測定了尿樣中的黃豆黃素和染料木苷。 m a z u r w 等【4 9 】采用同位素稀釋氣質(zhì)聯(lián)用法對食品中的黃豆苷和染料木苷進(jìn)行了測定。 系統(tǒng)采用離子火焰檢測器，以氮氣為載氣。 高效液相色譜質(zhì)譜法測定大豆異黃酮含量的方法文獻(xiàn)報道的不多。董懷海等 5 0 】 采用高效液相色譜質(zhì)譜法同時測定大豆異黃酮6 種組分，高效液相為w a t e r s2 6 9 0 ， 色譜條件：色譜柱s y m m e t r yc s ( 2 1m m x l 5 0r a m ) ，柱溫3 5 ，流動相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 的醋酸甲醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 的醋酸，梯度洗脫。質(zhì)譜為z m d4 0 0 0 ，正離子質(zhì)譜 條件：毛細(xì)管電壓4 1 0 0v ，一級錐孔電壓8 0v ，離子源溫度1 2 0 ，脫溶溫度2 0 0 。 l o 豆粕和分離蛋白乳清廢液中異黃酮的提取與分離 負(fù)離子質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓4 1 0 0v ，一級錐孔電壓1 0 0v ，離子源溫度1 2 0 ，脫 溶溫度2 0 0 。 龔凌霄等f 5 l 】將大豆胚芽、大豆粕等原料用6 0 乙醇水溶液提取，采用n o v a p a kc 1 8 柱( 3 9r l l l $ 1 1 5 0m n ，4 岫) ，流動相為o 1 乙酸水和0 1 乙酸乙腈，梯度洗脫， 柱溫4 0 ，檢測波長為2 5 41 1 1 1 1 ，外標(biāo)法定量，檢測時間2 3m i n ，分析大豆中8 種異 黃酮成分，質(zhì)譜條件：e s i ( + ) ，掃描范圍( m z ) 為5 0 - 6 0 0 ，毛細(xì)管電壓為3 5 0 0v ， 干燥溫度為3 5 0 ，干燥氣流速為9 0 l m i n ，噴霧器壓力為2 4 1 3 2 k p a 。根據(jù)色譜峰 的質(zhì)譜特征，鑒定出各種異黃酮，測定4 種異黃酮( 大豆苷、染料木苷、大豆苷元、 染料木苷元) 的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差( r s d ) 為0 5 1 2 ，回收率9 9 0 1 0 3 o 。 另外，還有電化學(xué)檢測，放射免疫性鑒定，核磁共振檢測，熒光檢測等。毛細(xì)管 電泳法具有快速高效，選擇性高，不需對產(chǎn)品進(jìn)行預(yù)處理，檢測范圍達(dá)到1 0 4 1 0 。9 級。 w a n g 等【5 2 】用毛細(xì)管電泳成功地分離了葛根中的5 種成分，包括染料木素、大豆 苷及大豆苷元等。于阿娟【5 3 】在研究大豆異黃酮的分離時，確定了其最佳電泳分離條 件：2 5m m o l l 硼酸鹽緩沖溶液( p h 為1 0 ) ，運行電壓為2 1 0k v ，檢測波長2 5 91 1 1 1 1 ， 進(jìn)樣壓差1 6c m 進(jìn)樣，毛細(xì)管有效長度為2 7c m ，進(jìn)樣2 0s ，在6m i n 內(nèi)完成測定。 羅維等【5 4 】利用包括氫檢測異核多量子相干譜( h m q c ) 核和氫檢測遠(yuǎn)程異核多量 子相干譜等多種二維核磁共振技術(shù)對大豆異黃酮的”c n m r 和1 h n m r 譜峰進(jìn)行了全 歸屬。 免疫檢測法多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)方面。w a n hj 等【5 5 1 通過免疫檢測法測定了人尿樣中的 包括黃豆黃素和染料木苷在內(nèi)的植物雌性激素，結(jié)果與同位素稀釋的g c m s 法的相 關(guān)系數(shù)很高，可達(dá)到0 9 5 0 9 9 。 1 6 大豆異黃酮產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用前景 t 6 1 國外情況 在國際上，大豆異黃酮作為健康食品的熱門課題已被列入全球十大最佳投資項目之 一【5 6 】。1 9 9 8 年美國a d m 公司率先建成全球第一家大豆異黃酮生產(chǎn)線，銷售額達(dá)1 9 億 美元。隨后日本和澳大利亞等國也陸續(xù)開始不同含量大豆異黃酮的分離、提純。隨著 f d a 批準(zhǔn)將大豆異黃酮作為健康食品上市，接下來不過幾年時間便迅速形成了一個大豆 異黃酮產(chǎn)業(yè)，2 0 0 0 年在德國法蘭克福舉辦了第一屆國際健康食品配料展，其中大豆異 黃酮是最熱門的話題。德、美、英、法、荷、比、日、以色列、西班牙等國的2 8 家 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 企業(yè)展示了大量涉及大豆異黃酮的產(chǎn)品和資料，并向觀眾展示了異黃酮的四大功能， 即婦女保健、心臟保健、降低血脂、改善骨質(zhì)疏松。有資料顯剝”，目前美國市場上 已有3 0 0 多種大豆異黃酮功能食品，年銷售額近2 0 億美元。 當(dāng)前，發(fā)達(dá)國家市場上已有大豆異黃酮的各種制劑，如片劑、口服液、粉劑等。高 純度的大豆異黃酮已應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)。美國、歐洲、日本及澳大利亞等一些發(fā)達(dá) 國家已開發(fā)出富含異黃酮的大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、醬油、飲料、茶、豆粉、奶 粉、酸奶、面包、黃油、巧克力、冰淇淋等多種保健食品，成為市場上的暢銷食品。日 本一家公司己開發(fā)出水溶性高、苦澀味較少的制品，稱之為“富士黃酮”，可應(yīng)用于飲 料、甜點心之類的健康食品；日本豐年公司還開發(fā)了“