吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 摘要 本論文旨在通過小白鼠試驗給出紅曲多糖的毒理特征和對提高機體免疫力的作用。并 通過u v 誘變紅曲霉篩選紅曲多糖的高產(chǎn)菌株，優(yōu)化其液體發(fā)酵條件。研究了影響紅曲多糖 提取率和純化程度的主要因素。通過一系列試驗，初步給出了紅曲多糖的理化性質(zhì)、分子 量、結(jié)構(gòu)、以及組成成分等。 首先對紅曲霉斜面培養(yǎng)基進行了研究，通過試驗確定了麥芽汁糖化工藝，確定了斜面 培養(yǎng)基：麥芽汁糖度6 - 8 5 波美度，p h 6 7 ，2 瓊脂。 正常灌胃紅曲多糖2 1 天后，稱量小鼠體重，并將肝、脾、腎、心、肺分別稱重，計算 臟體指數(shù)。結(jié)果可以看出，紅曲多糖能增加肝臟質(zhì)量，增加脾臟質(zhì)量，而高濃度又降低脾 質(zhì)量，對其他各個器官無明顯的不良影響。而且從s g p t 含量來看，紅曲多糖能顯著降低其 含量，而對血糖含量和s g o t 含量影響不明顯。結(jié)論是紅曲多糖對小鼠無明顯的毒害作用。 通過d t h 試驗，小鼠經(jīng)灌胃紅曲多糖后，其足跖腫脹度與對照組差異明顯，說明紅曲 多糖能提高小鼠細胞免疫功能。在三氯甲烷致中毒試驗中，和對照組相比，試驗組s g p t 含 量有所降低說明紅曲多糖有保肝護肝作用。碳粒廓清試驗，給小鼠灌胃紅曲多糖，能使廓 清速率大幅增加表明紅曲多糖可提高腹腔巨噬細胞吞噬能力，促使小鼠外周血e 一玫瑰環(huán)形 成，增加體內(nèi)淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，使非特異性免疫加強。游泳試驗和耐缺氧能力試驗似乎說 明紅曲多糖在提高機體耐疲勞能力和缺氧條件下生活能力方面作用不大，有待進一步研究。 利用紫外線對出發(fā)菌株紅曲霉a s3 4 7 0 1 進行誘變處理，經(jīng)過初篩確定了最佳誘變劑 量： 2 5 4n l n ，2 0r a i n 。再經(jīng)過復(fù)篩獲得了一株最佳突變株z l t - 1 0 0 ，該突變株經(jīng)連續(xù)三次 傳代，結(jié)果紅曲粗多糖的產(chǎn)量分別是4 2 6 9 l ，4 6 9 9 l ，4 1 0 9 l ，平均4 3 5 9 l 。證明該 茵株具有穩(wěn)定的遺傳性，比出發(fā)菌株提高產(chǎn)量2 8 6 。 通過三組試驗，包括：( 1 ) 發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗；( 2 ) 無機元素的含量確定的平 行試驗；( 3 ) 優(yōu)化的發(fā)酵條件驗證試驗。得出結(jié)論：紅曲霉在經(jīng)過斜面培養(yǎng)后， 以大米漿 為基礎(chǔ)培養(yǎng)物( 固形物1o ) ，加入i q a n o ，0 1 5 ，m g s o ；7 h ：o0 1 5 ，k h ：p o 。0 2 5 ，溫 度3 5 ，2 2 0 r m i n 搖床培養(yǎng)9 6 小時，再經(jīng)4 0 0 0 r m i n 離心5 m i l l ，2 4 小時醇沉，電熱鼓 風(fēng)干燥等操作，產(chǎn)多糖量5 5 3 9 l ，高出初始條件2 7 。 通過正交試驗優(yōu)化得最佳提取條件為：浸提溫度9 0 ；浸提料液比1 ：3 ；浸提時間 3 0 m i n 。紅曲多糖的產(chǎn)量為6 6 6g l ，高出初始條件2 0 。 利用苯酚一硫酸法測得紅曲粗多糖中總糖含量為7 8 ；利用3 5 一二硝基水楊酸法測定還 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 原糖含量為1 2 5 ；則多糖含量6 5 5 。利用考馬斯亮藍法測定可溶蛋白含量為5 2 。 通過試驗確定了紅曲粗多糖的純化工藝，s e v a g 法除雜蛋白，透析帶除鹽及小分子物 質(zhì)，s e p h a d e xg 一2 0 0 柱層析，收集峰值的糖，冷凍干燥得紅曲多糖純品。 紙層析上只有一個海藍色斑點，表明紅曲多糖是單一純物質(zhì)。確定了展開劑為正丁醇一 乙醇一水( 1 2 ：3 ：5 ) 。s e p h a d e xg - 2o o 柱層析呈單洗脫峰表明多糖組分均一。 通過一系列生化試驗，紅曲多糖粗品為淺紅色粉末，純品為白色粉末，較易溶于水， 水溶液粘稠，p h 6 左右，無色無味，1 的紅曲多糖水溶液粘度4 6 0 m p a s ，與碘試劑不呈藍 色。苯酚一硫酸反應(yīng)呈桔紅色，蒽酮試劑反應(yīng)呈藍綠色，比旋光度【c 【】”。= 1 6 6 。不溶于 高濃度乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。 本試驗采用雙向薄層層析方法，紅曲多糖經(jīng)2 m o l l 硫酸水解，展開劑氯仿：甲醇：水 = 1 6 ：9 ：2 ，對紅曲多糖的組分進行了測定，基本確定了紅曲多糖中舍有甘露糖、葡萄糖、 半乳糖。 采用s e p h a d e xg - 2 0 0 進行凝膠過濾層析，上樣量5 m g l m l ，0 1 m o l l i l a c l 溶液洗脫， 利用已知分子量的葡聚糖做標準曲線，測定紅曲多糖分子量為3 1 6 萬。 紅外光譜i r 分析：將2 m g 紅曲多糖純品與2 0 0 r a g 純k b r 研細混合均勻在油壓機上壓成 透明薄片，在t j 2 7 0 - 3 0 紅外分光光度計上i r 分析，掃描范圍4 0 0 0 4 0 0 c m ，得出紅曲多 糖是d 一吡喃型多糖。 通過該研究，證明了紅曲多糖對生物有機體沒有毒害作用，對提高機體免疫力有明顯 效果。通過結(jié)構(gòu)和組成研究，證明了紅曲多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖， 具有d 一吡喃構(gòu)型，進一步佐證了紅曲多糖具有提高機體免疫力的作用。因而通過大量的 誘變篩選得一株高產(chǎn)多糖的優(yōu)勢菌株，并優(yōu)化了液體發(fā)酵條件，優(yōu)化了提取條件，純化條 件可以指導(dǎo)生產(chǎn)，并可以后續(xù)開發(fā)幾種保健食品和飲料，以提高亞健康人群的免疫水平。 關(guān)鍵詞：紅曲多糖紫外誘變免疫作用g - 2 0 0 層析雙向?qū)游黾t外光譜 j i 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 a b s t r a c t t h i sp a p e ri sa i mt og i v eo u tt h et o x i c o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h ee f f e c to ni m p r o v i n g i m m u n i t yb ym i c ee x p e r i m e n t s c r e e n i n gt h eh i g hy i e l ds t r a i no fp o l y s a c c h a r i d e sb yu v m u t a t i o nm e t h o d ，a tt h es a m et i m e ，w eo p t i m i z e dt h el i q u i df e r m e n tc o n d i t i o n ，s t u d i e dt h em a i n f a c t o r so fe x t r a c t i o nr a t ea n dt h ed e g r e eo fp u r i f i c a t i o no fp o l y s a c c h a r i d e s u n d e rs e r i e so f e x p e r i m e n t s ，t h ep h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，m o l e c u l a rw e i g h t ，m o l e c u l a rs t r u c t u r ea n d c o m p o s i t i o no f p o l y s a c c h a r i d e sh a v eb e e ng i v e n a b o v ea l lw es t u d i e dt h eb e v e lc u l t u r em e d i u m ，f o u n dt h ew e f ts a c c h a r t f y i n gt e c h n o l o g y ， a n dt h eb e v e lc u l t u r em e d i u mi s ：t h es u g a rd e g r e eo f w e f ti s6 - 8 5b a u m e ，p h6 - 7 ，a g a r2 a f t e r2 1 d a y s w ew e i g h e dt h ea v o i r d u p o i so fm i c en o r m a l l yp o u r e ds t o m a c hb y p o l y s a c c h a d d e s ，a n dw e t g h e dt h el i v e r ，s p l e e n ，k i d n e y , h e a r t , l u n ga n dr e c o r d e dt h ei n d e xo f t h e o r g a n sr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l ts h o w st h a tt h e e x p e r i m e n t t h el o w e rc o n c e n t r a t i o n p o l y s a c c h a r i d e s c a ni n c r e a s et h el i v e r q u a l i t y ，s p l e e nq u a l i t y , b u th i g h c o n c e n t r a t i o n p o l y s a c c h a r i d e sc o u l dr e d u c et h es p l e e nq u a l i t ya n dt h e r ei sn 0b a de f f e c to nt h eo t h e ro r g a n s s e e nf r o mt h ec o n t e n to fs g p t , p o l y s a c c h a r i d e sc o u l dl o w e rt h ec o n t e n to fs g p to b v i o u s l y , b u t n o a p p a r e n t e f f e c to nt h ec o n t e n to fb l o o d - s u g a ra n ds g o t t h ec o n c l u s i o ni st h a t p o l y s a e c h a r i d e sh a sn oa p p a r e n tt o x i ce f f e c to nt h em i c e t h r o u g ht h ed t he x p e r i m e n t ，a f t e rp o u r i n gt h ep o l y s a e c h a r i d e si n t os t o m a c ht h em i c e s f e e ts w o l l e nd e g r e eh a so b v i o u sc h a n g e sc o m p a r e dw i t ht h er e f e r e n c et e a m t h ee x p e r i m e n t i l l u m i n a t e dt h a tp o l y s a c c h a r i d e sc o u l di m p r o v et h em i c ec e l l u l a ri m m u n i t y i nt h ee x p e r i m e n to f c h l o r o f o r mf i n ep o i s o n i n g ，c o m p a r e dw i t hr e f e r e n c et e a mt h es g p tc o n t e n to ft h ee x p e d m e n t e d t e a mh a sb e e nl o w e r e dw h i c hi l l u s t r a t e dp o l y s a c c h a r i d e sc a l lp r o t e c tl i v e r i nt h ee x p e r i m e n to f c a r b o ng r a n u l ec l e a r a n c er a t e ，p o l y s a c c h a r i d e sc a l li m p r o v ea b d o m i n a lc a v i t ym a c r o p h a g e p h a g o c y t i z ea b i l i t y , p r o m p tt h e f o r m a t i o no f p e r i p h e r yb l o o de - r o s el o o p ，i n c r e a s et h e t r a n s f o r m a t i o nr a t eo fv i v ol y m p h o c y t ea n ds t r e n g t h e nn o n s p e e i f i ci m m u n i t yb yp o u r i n g p o l y s a c c h a r i d e s b yt h es w i m m i n ge x p e r i m e n ta n dr e s i s t a n c et oh y p o x i ae x p e r i m e n lw e k n e w t h a tt h ee f f e c to fp o l y s a c c h a r i d e si sn o ta p p a r e n t0 ni m p r o v i n gr e s i s t a n c et oh y p o x i ac a p a b i l i t y a n dv i a b i l i t ya ta n o x i cc o n d i t i o n ，w h i c hn e e d su ss t u d yi nf u r t h e r s t e p n i 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文紅曲鄉(xiāng)糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 z h 1 0 0i st h ev a r i a n ts t r a i no fm o n a s c u sa s3 4 7 0 1 t h r o u g hu l t r a - v i o l e tm u t a t i o n s r a d i a t i o nt r e a t m e n t s ，t h eo p t i m a lm u t a t i o n d o s ei s2 5 4 n m ，2 o m i n a f t e rz h 一1 0 0h a sb e e n c u l t u r e d3g e n e r a t i o n s ，t h ey i e l do f p o l y s a c c h a r i d e si s4 2 6 9 l ，4 6 9 9 l ，4 ，1 0 9 l ，a n dt h ea v e r a g e i s4 3 5 9 l t h i sr e s u l tp r o v e dt h a tz h 一1 0 0h a v es t e a d yt r a n s m i s s i b i l i t ya n di ti sh i g h e r2 8 6 t h a n m o n a s c u ss p 3 4 0 7 1 s t i l la n o t h e rt h r e ee x p e r i m e n t s 1 t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n to nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n 2 ， p a r a l l e le x p e r i m e n to nt h ei n o r g a n i ce l e m e n t 3 t e s to ft h eo p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t i o n ， c o n c l u s i o nc a nb ed r a w nt h a t ：r i c ep l a s ma st h ec u l t u r em e d i u m ( s o l i d1 0 ) ，n a n 0 3 0 1 5 。m g s 0 4 7 h 2 00 1 5 ，k 2 h p 0 4o 2 5 ，t e m p e r a t u r e3 5 c ，4 0 0 0 r m i n ，t i m e9 6 h t h ey i e l d o f p o l y s a c c h a r i d e si s5 5 3g lh i g h e r2 7 t h a nt h ei n i t i a l b yt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tt h eo p t i m a le x t r a c t i o nc o n d i t i o ni s ：t e m p e r a t u r ei s9 0 1 2 ；t h e r a t eo fm a t e r i a lt ol i q u o ri s1 ：3 ：t i m ei s3 0m i n t h ey i e l do fp o l y s a c c h a r i d e si s6 6 6g lh i g h e r 2 0 t h a l lt h ei n i t i a l t h et o t a ls u g a rc o n t e n ti s7 8 ，m e a s u r e dt h r o u g hc a r b o l i ca c i d s u l f u r i ca c i dm e t h o d r e d u c i n gs u g a rc o n t e n ti s1 2 5 ，m e a s u r e db y3 5d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d ，p o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n t i s6 5 5 ，t h es p e c i m e ns o l u b l ep r o t e i nc o n t e n ti s5 2 ，m e a s u r e db yc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e m e t h o d s t h ep u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yo fm o n a s c u sr a wp o l y s a c c h a r i d e sh a sb e e nt e s t i f i e db y e x p e r i m e n t w eg o tr i do fs u n d r yp r o t e i nw i t hs e v a g em e t h o d ，t o o ko u to fs a l ta n ds m a l l m o l e c u l a rs u b s t a n c ew i t hd i a l y s e s ，s e p a r a t e dp o l y s a c c h a r i d e sw i t hs e p h a d e xg 一2 0 0c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a tl a s t ，w eg o tt h ep u r ep o l y s a c c h a r i d e st h r o u g hc o l l e c t i n ga n de v a p o r a t i n g s e p a r a t e dp o l y s a c c h a r i d e s t h e r ew a so n l yo n ea q u a m a r i n es p o to np a p e rc h r o m a t o g r a p h y r e s u l ts h o w st h a tt h e p o l y s a c c h a r i d e sw ec o l l e c t e di sap u r es u b s t a n c e a n dc o n f i r mt h a tt h ed e v e l o p e ri sn o r m a lb u t y l a l c o h o l - e t h a n o l w a t e r ( 1 2 ：3 ：5 ) s e p h a d e xg - 2 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yh a das i n g l ee l u t i n g p e a kt h a td e m o n s t r a t e dt h ep o l y s a c c h a r i d ew a sh o m o g e n e i t y t h r o u g hac h a i no fb i o c h e m i c a le x p e r i m e n t ，w ed r e wt h ec o n c l u s i o nt h a tp o l y s a c c h a r i d e s c r u d ep r o d u c ti sal i g h tr e dp o w d e r , v i r g i ni sak i n do f w h i t ep o w d e ra n de a s yt od i s s o l v ei nw a t e r t h ew a t e rs o l u t i o nw a st h i c k n e s s ，p hw a sa b o u t6 t h a ti so fa c h r o m a t i s ma n di n s i p i d i t y t h e i v 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 v i s c o s i t yo fp o l y s a c c h a r i d e sw a t e rs o l u t i o n ( 1 ) w a s4 6 0 m p a s ，c a nn o ts u b m i tb l u er e a c t e d w i t hi o d i n er e a g e n t t h er e a c t i o no fh 2 s 0 4 - p h e n o la n dp o l y s a c c h a r i d e ss h o w sn a c a r a t ；t h e r e a c t i o no fa n t h r a c e n e k e t o n er e a g e n ts h o w sc y a n ；s p e c i f i cr o t a t o r yp o w e r 【a 尸d = 1 6 6 i ti s c a n n o tb ed i s s o l v e di n t oh i g hc o n c e n t r a t i o ne t h a n o l ，a e t h e r , a c e t o n e ，h e x y la c e t a t ee t c t h ee s s a ya d o p t st h em e t h o do ft w o w a yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y p o l y s a c c h a r i d e sw a s h y d r o l y z e db y2 m o l lv i t r i 0 1 d e v e l o p e rc h l o r o f o r m ：m e t h a n o l ：w a t e r = 16 ：9 ：2 b ym e a s u r i n g p o l y s a c c h a r i d e sc o m p o n e n t s ，w ek n e wt h a tp o l y s a c c h a d d e sc o n t a i n sm a n n i t o s e ，g l u c o s ea n d g a l a c t o s e p r o c e s s e dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h yb ys e p h a d e xg 一2 0 0 ，w eg o tt h ev o l u m eo nt h e c h r o m a t o g r a p h yi s5 m g l m l ，0 1 m o l l n a c l e l u t i o ns o l u t i o n t h es t a n d a r dc u r v ei s d r a w n ， a c c o r d i n gt ot h eg i v e nm o l e c u l a rw e i g h t t h em o l e c u l a rw e i g h to f p o l y s a c c h a r i d e si s316 k d i n f r a - r e ds p e c t r aa n a l y s i s ：p o r p h y r i z e2 0 0 m gp u r ek b ra n d2 m gp u r ep o l y s a c c h a r i d e s ， b l e n du n i f o r m i t ya n dp r e s s u r eb yo i lp r e s si n t ot r a n s p a r e n c ef l a k e i ra n a l y s e db yt j 2 7 0 3 0 i n f r a r e ds p e c t r o p h o t o m e t e r , s c a n n e da r e a4 0 0 0 4 0 0 c m ，w ed r e wt h ec o n c l u s i o nt h a t p o l y s a c c h a r i d e sw a sd p y r a n o i df o r mp o l y s a c c h a r i d e g e n e r a l l ys p e a k i n g ，t h e s ee x p e r i m e n t si l l u s t r a t e st h a tp o l y s a c c h a r i d e sh a dn ot o x i ce f f e c t o nb i o l o g yo r g a n i s m ，b u ti tc o u l di m p r o v et h ei m m u n i t yo fb o d yg r e a t l y b ys t r u c t u r ea n d c o m p o s es t u d y i n g , w ek n o wt h a tp o l y s a c c h a r i d e si sak i n do fh e t e r o g l y c a nw h i c hi sc o m p o s e d w i t hm a n n i t o s e ，g l u c o s ea n dg a l a c t o s e p o l y s a c c h a r i d e si sb p y r a n ec o n f i g u r a t i o nw h i c hp r o v e s t h ec o n c l u s i o no fi m p r o v i n gi m m u n i t yo fb o d y t h ep r e d o m i n a n c es t r a i no fh i g h y i e l d i n g p o l y s a c c h a r i d eh a sb e e ns c r e e n e dt h r o u g hs u b s t a n t i v em u t a t i o n t h e nw eo p t i m i z e dt h el i q u i d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，a b s t r a c t i o nc o n d i t i o na n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n a n dt h et h e o r yc o u l d i n s t r u c tp r o d u n i o na n de x p l o i tk i n d so fh e a l t hf o o da n db e v e r a g e ，w h i c ha i m sa ti m p r o v et h e i m m u n i t yl e v e lo fs u b h e a l t hc r o w d k e y w o r d s ：m o n a s e u sp o l y s a c c h a r i d e s ；u l t r a v i o l e tm u t a t i o n ；i m m u n i z a t i o n ； g - 2 0 0e h r o m a t o g r a p h y ；t w o - w a yc h r o m a t o g r a p h y ；i n f r a r e ds p e c t r u m v 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。 據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫 過的研究成果，也不包含為獲得吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名：張建峰簽字目期：2 0 0 5 年5 月2 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即吉林農(nóng)業(yè) 大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。 本人授權(quán)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以 采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本 授權(quán)書) 學(xué)位論文作者簽名：張建峰導(dǎo)師簽名：陳光 簽字日期：2 0 0 5 年5 月2 日簽字日期：2 0 0 5 年5 月1 0 曰 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 工作單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 通訊地址；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 電話：4 5 3 2 8 8 6 8 0 0 5 郵編：1 3 0 1 1 8 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 第一部分前言 1 多糖的定義與結(jié)構(gòu) 糖類化合物是自然界中分布最廣、數(shù)量最多的有機化合物，從最簡單的細菌到高等植 物和高等動物都含有各種糖類。糖是多羥基的醛或酮及其縮聚物和衍生物。單糖是最簡單 的糖，不能被水解為更小的糖單位( 重要的單糖見圖1 ) 。多糖是由多個單糖基以糖苷鍵相 連而成的高聚物，一般是2 0 個以上的單糖聚合而成。多糖完全水解時，糖苷鍵斷裂而變成 為寡糖、二糖，最后變?yōu)閱翁?。根?jù)來源不同，自然界中有植物多糖、動物多糖和微生物 多糖。 多糖沒有還原性和變旋現(xiàn)象，無甜味，大多數(shù)多糖不易溶于水，有的與水形成膠體溶 液。多糖的結(jié)構(gòu)因其分子量大很復(fù)雜。如果多糖中完全是由相同的單糖組成的稱為同多糖， 由不同的單糖組成的則稱為雜多糖。如果按多糖分子中有無支鏈，則可分為直鏈多糖和支 鏈多糖。支鏈的豐度和性質(zhì)對一( 1 3 ) 葡聚糖的免疫活性也有較大影響。支鏈分支度較 高的b ( 1 3 ) 葡聚糖生物活性較強。如果糖類化合物中還含有非糖物質(zhì)，則稱為復(fù)合多 糖，例如糖脂、糖蛋白等。“ 當(dāng)糖分子形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)時，c - l 便成為不對稱碳原子，可有型和p 型兩種異構(gòu)體形 成( 見圖2 ) 。而多糖的分子構(gòu)型對其免疫調(diào)節(jié)活性及抗腫瘤活性起著至關(guān)重要的作用，其 活性成分的結(jié)構(gòu)前提是在多糖骨架鏈上占優(yōu)勢交替的b 一( 1 3 ) 糖苷鍵。單糖的n 或b 構(gòu)型 是決定糖苷鍵定向及空間構(gòu)象的關(guān)鍵因素之一。由p 型葡萄糖組成的b 一( 1 3 ) 葡聚糖有利 于卷曲成螺旋結(jié)構(gòu)，具有較高的免疫活性及抗腫瘤活性：而由n 型葡萄糖組成的a 一( 1 3 ) 葡聚糖形成的是具有一種帶狀的單鏈構(gòu)象，沿著纖維軸伸展而不是呈螺旋狀，所以沒有 生物活性或生物活性很低。另一方面，主鏈結(jié)構(gòu)同是b 一( 1 3 ) 又有b 一( 1 6 ) 側(cè)鏈的葡聚 糖，有些具有強的活性，而有些卻無活性。長期研究發(fā)現(xiàn)，具有抗腫瘤活性的多糖大多是 由b 一( 卜3 ) 鍵連接的d 葡聚糖。0 1 糖分子形成半縮醛環(huán)狀結(jié)構(gòu)時c 一1 和c - 5 通過氧原予形成一個含氧六元環(huán)，與吡喃的 結(jié)構(gòu)相似，所以具有這樣的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的稱毗喃糖。環(huán)狀結(jié)構(gòu)單糖中五元氧環(huán)稱呋喃環(huán)。這 種結(jié)構(gòu)上的不同也與其功能性多糖的生物活性密切相關(guān)?！? ( 見圖2 和3 ) 紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 l _ l i i 1 一l i i f j - - c ) - - 暑 8 一寶 “ 豇l l 1 0 zx 5 一l l l 一5 8 一l l 一5 弋g 一一。一一； s l 囊 l 。嶝一“8 - o 、善1 8 一峨 s l l 一目；l 墨墨 冪 g l l l 一 豇l l l l 一； 一l l s 0 一l i o k ：i l l l 一 z善 、乳l 喜l 1 8 一 譬o _ z u 薯董u z o 十8 = 皂_ 舀 z q v 0 譬皂z o 著z h u 墨o h z u 一 一 一 一 一 一 一 一 zo譬_宅z z 8 王 =oo孟_喜z 譬 岳譬 z o o z 王o o z 一 一 一 一 一 一 一 一 z8墨囂u暈_ 譬uoi工u竄_n凸z z 百z 譬o o z z o o 毒 z肆vz霉 t 8 蔓 =o牮_十50z z 譬v 王 z 8 王 z o o 寅 一 一 一 一 一 一 一 一 z8霉_晷z 王u o 盤 zoo宣_古oz z o u z 雹8 z = 凸l 。z 一 一 一 一 一 0 5 o 叩8 o _ 8 o z u o ，8 b 十i 。 量u s !： ；，l 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 c h 0 伽、與 中一呻5“叩一呻6 h 茹c o h 警j 甲l l “s _ j 6 h 2 0 h h 柵 a d 毗葡萄糖d 一葡萄糖 ，一d 毗葡聾靖 尊商h o h t 匕晴 a - d 一蕾萄糖 蘆一d 一葡萄糟 圖2 糖的立體構(gòu)型i f i g2 t h et h r e e - d i m e n s i o n a lc o n f o r m a t i o nio f g l u c i d e h o h w 刪h 搏 呋 # - d 啾晴果膏盧一d 吡嘣秉糖 刪辯m 斟蜉h 8 - d 快哺棱糖p d 脫氯呋哺棱糖p - d 吡嘯棱膏 d 術(shù) 鏟h 毫h - - i - - o h h l 舡h(huán) d 飯口一n 螂轅精 圖3 糖的立體構(gòu)型 f i g3 t h et h r e e d i m e n s i o n a lc o n f o r m a t i o nl io f g l u c i d e 3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 紅曲多糖高產(chǎn)菌株的篩選及其提取純化免疫活性研究 2 真菌多糖的概述 真菌多糖存在于葭絲、子實體及其發(fā)酵液中，是由2 0 個以上的單糖以糖苷鍵連接而成 的高分子多聚物，具有復(fù)雜的生物活性和功能。其中，最主要的就是免疫調(diào)節(jié)活性。1 目 前，真菌多糖已廣泛應(yīng)用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和腫瘤等疾病的臨床治療及醫(yī)藥 領(lǐng)域的其他用途，如制各醫(yī)藥材料、藥物緩釋劑、血漿代用品等u ，。 近年來，真菌多糖及其復(fù)合物的研究引起越來越多的關(guān)注，已成為分子生物學(xué)、醫(yī)藥 學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點之一。目前，研究比較多的有香菇多糖、銀耳多糖、云芝 多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、裂褶菌多糖、豬苓多糖、猴頭菌多糖、金針菇多糖、黑木耳 多糖、核盤菌多糖、灰樹花多糖、冬蟲夏草多糖等“3 。 例如香菇多糖的主鏈為1 3 一( 1 3 ) d 葡聚糖，具有1 3 一( 1 3 ) 支鏈和b 一( 1 6 ) 支鏈。香 菇多糖是一種免疫激活劑，能激活巨噬細胞和淋巴細胞，提高巨噬細胞的趨化性和淋巴細 胞對y a c 一1 細胞和p 一8 1 5 細胞的毒性反應(yīng)水平，促進小鼠腹腔巨噬細胞釋放t n f ，拮抗b b n 對小鼠的致癌作用，促進i l l 、克隆刺激因子( c s f ) 和白細胞介素3 ( i l 一3 ) 的產(chǎn)生，并因此 促進淋巴細胞成熟、分化和增殖。香菇多糖可增加胸腺細胞對幫助因子( h e l p e r f a c t o r ) 的敏感性，促進這些細胞向t 細胞的分化，也可刺激正常人或癌癥患者對外周淋巴細胞增 生，從而提高宿主抑制腫瘤生長的能力。1 ，激活巨噬細胞，能選擇性提高小鼠腹腔巨噬細 胞的活性，并使其絕對數(shù)量增長0 1 。香菇多糖對小鼠s 。肉瘤的抑制率可達7 0 1 0 0 ，有 9 0 的小鼠腫瘤完全消退，還能抑制化學(xué)致癌劑3 一甲蒽醌的致癌作用”1 。 又如茯苓多糖對細胞免疫偏低者有很強的促進細胞免疫作用”1 ，能明顯增強脾t 淋巴 細胞對c o na 刺激的增殖反應(yīng)，同時提高小鼠外周t 淋巴細胞a - a n a e 陽性率“”，且能調(diào) 整t 細胞亞群的比值，增強機體免疫功能，改善機體狀態(tài)，增強抗感染能力，還能激活b 淋巴細胞，增強其活性。茯苓多糖對小鼠s 。和e a c 瘤株有明顯抑制作用，能明顯抑制小 鼠腹水型肉瘤、人慢性骨髓性白血病k 。細胞增殖，對s 。細胞膜磷脂酰肌醇( p i ) 轉(zhuǎn)換有 明顯抑制作用：能顯著改變其磷脂的脂肪酸組成，降低花生四烯酸的含量：且能使腫瘤細胞 膜唾液酸( s a ) 升高o “。茯苓多糖還能增強巨噬細胞識別功能，提高巨噬細胞的吞噬率和吞 噬指數(shù)，并能通過增強腫瘤壞死因子( t n f ) 基因的轉(zhuǎn)錄而增加巨噬細胞釋放t n f ，并增強t n f 的活性。 總之，真菌多糖作為一類重要的生物活性物質(zhì)，是目前公認的有較高療效的免疫增強 劑，國內(nèi)外學(xué)者對真菌多糖的制備、結(jié)構(gòu)、合成、藥理學(xué)、臨床學(xué)等方面做了很多工作， 其多方面的生物活性已經(jīng)得到開發(fā)和應(yīng)用，云芝多糖、豬苓多糖、香菇多糖、裂褶菌多糖、 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文紅曲多糖高產(chǎn)苗株的篩選及其提取純化免疫活性研究 茯苓多糖等多種真菌制劑已取得了較好的臨床效果?！?3 紅曲多糖的概述 紅曲是我國藥食同源的典型代表，其藥用價值在本草綱目獸醫(yī)草本中都有記載， 具有殺菌、防腐、解毒、消食、活血、健脾等功效。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，紅曲具有降血 壓、降血脂和降膽固醇、增強肌體免疫力的作用。 但是，關(guān)于紅曲的生理功能及其有效活性成分，卻一直不清楚。直到1 9 7 9 年日本遠藤 章教授從紅色紅曲霉( m o n a s c u sr u b e r ) 中分離出一種命名為摩那可林k ( m o n a c o l i nk ) “”的生理活性物質(zhì)，引起了全世界科學(xué)家對紅皓霉，紅曲米的關(guān)注。 九十年代出現(xiàn)了全世界范圍的功能性多糖的研究熱潮，1 9 9 8 年南京大學(xué)生物系田軍等 發(fā)現(xiàn)了紅曲的另一個生物活性成分紅曲多糖，并對其理化性質(zhì)做了研究“。2 0 0 2 年武漢工 業(yè)學(xué)院陳運中研究了紅曲色素、多糖與核酸的聯(lián)合制備o “。同年無錫輕工大學(xué)的諸葛健等 人優(yōu)化了紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的工藝，以麥芽糖為碳源、蛋白胨為氮源，多糖提取量達 到3 2 4 9 l “。目前國內(nèi)期刊可檢索的有關(guān)紅曲多糖的文章僅有三篇，尚未見外文報道。 4 本論文的研究目的和意義 綜上闡述真菌多糖具有許多重要的生物功能，各國學(xué)者從各種真菌體內(nèi)及發(fā)酵液中提 取了大量活性多糖，發(fā)現(xiàn)多糖具有促進機體免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤、 抗輻射以及改善動物生產(chǎn)性能等一系列作用。但是紅曲多糖的毒理、藥理、動物免疫試驗 未見報道，本研究準備做小白鼠試驗以添補這項空白。 第二點，紅曲多糖的結(jié)構(gòu)及組成研究只有一篇文章論述，而且作者認為數(shù)據(jù)不夠準確， 有些內(nèi)容經(jīng)多次試驗證明難以實現(xiàn)，所以作者準備對其結(jié)構(gòu)和組成、分子量等內(nèi)容進行深 入研究。 第三點，紅曲多糖的分離、提取、純化工藝未見報道，作者準備優(yōu)化提取工藝，盡最 大可能提高紅曲多糖的收率。 第四點，紅曲多糖的產(chǎn)率低是限制其應(yīng)用的最大問