實(shí)驗(yàn)5電泳技術(shù),1,5.1電泳技術(shù)分類,5.1.1電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動的現(xiàn)象。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們在某個(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。5.1.2電泳技術(shù)：1936年瑞典學(xué)者蒂塞利烏斯設(shè)計(jì)制造了移動界面電泳儀，分離了馬血清白蛋白的3種球蛋白，創(chuàng)建了電泳技術(shù)。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定的技術(shù)。在生命科學(xué)研究中電泳技術(shù)主要用于蛋白質(zhì)、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物質(zhì)的分離和對分離物質(zhì)的純度與分子量的測定。,2,5.1.3電泳技術(shù)的分類：自由界面電泳：是不含支持物的電泳。溶質(zhì)在自由溶液中泳動，故也稱自由電泳，適用于高分子的檢測，但不易完全分離。區(qū)帶電泳：是含有支持物的電泳，支持物上混合樣品被置于狹小的區(qū)帶中泳動，分離出彼此分離的區(qū)帶。支持物有很多種，由此又衍生出區(qū)帶電泳的不同分支。,3,在生物技術(shù)研究中區(qū)帶電泳應(yīng)用最為廣泛！區(qū)帶電泳的分類：（1）按支持物的物理性狀不同分為：紙電泳：支持物為濾紙;粉末電泳：如纖維素粉，淀粉，玻璃粉電泳；凝膠電泳：淀粉膠，瓊脂糖，聚丙烯酰胺凝膠電泳；緣線電泳：如尼龍絲，人造絲電泳（2）按支持物的裝置形式不同分為：水平板電泳：支持物水平放置，是最常用的電泳方式；垂直板電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳。柱狀（管狀）電泳：聚丙烯酰胺凝膠可灌入適當(dāng)?shù)碾娪竟苤凶龀晒軤铍娪尽?4,凝膠電泳（以蛋白分離為例）：（1）單向電泳：在聚丙烯酰胺凝膠上分離，適于分離種類較少的蛋白。（2）雙向電泳：第一向使用預(yù)制膠條進(jìn)行蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，第二向?qū)⒛z條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚丙烯酰胺凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小與第一向相垂直分離。用于蛋白質(zhì)的分離，可將提取的蛋白質(zhì)混合物中數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離開。,5,5.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,5.2.1背景介紹：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳于1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。他們發(fā)現(xiàn)樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑（SDS）以后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。,6,5.2.2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：（1）陰離子去污劑SDS破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。（2）結(jié)合了SDS的蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物其橢圓棒的短軸長度恒定，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。（3）這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電場作用下，其遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根據(jù)這一特點(diǎn)，就可以將各蛋白組分按分子量大小分開。,7,濃縮膠,電泳開始時(shí)氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。Gly-Pro-Cl-,-,+,8,分離膠,孔徑較小,通過選擇合適的凝膠濃度,可以使樣品很好的分離.當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠,pH,凝膠孔徑改變,使慢離子的泳動率變大,超過蛋白,高強(qiáng)度電廠消失.因此蛋白在均一的pH,和電場強(qiáng)度下通過分離膠.如果蛋白質(zhì)分子量不同,通過分離膠受到的阻力不同，泳動率也不同,因此能夠根據(jù)蛋白的分子量不同而分開.Pro1-Pro2Gly-Cl-,-,+,積層膠,分離膠,9,SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價(jià)值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“甲叉雙丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時(shí)孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”為1：29配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。,凝膠分離范圍,10,凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用515%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：,雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為1：29,11,5.2.3體系中各成分的作用：（1）SDS作用：SDS是陰離子型表面活性劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，再與PAGE技術(shù)結(jié)合，則譜帶差異更加明顯、清晰，并可測定蛋白質(zhì)分子量，SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量的差異將各種蛋白質(zhì)分開。（2）電泳緩沖液中甘氨酸作用：樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界,而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域,它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。,12,（3）上樣緩沖液作用：蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一種以溴酚藍(lán)為染料，5倍濃縮的SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的SDS-PAGE蛋白電泳樣品上樣。一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴(kuò)散出來到電泳緩沖液中。指示劑檢測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿。,13,5.2.4實(shí)驗(yàn)步驟：制膠灌膠（灌分離膠加蒸餾水灌濃縮膠）插入梳子加緩沖液（上、下兩部分）拔掉梳子加樣品蓋上蓋子，接通電泳儀電源染色脫色,14,垂直板電泳裝置,加樣,樣品遷移方向,15,電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。,混合樣品,帶孔膠,按分子大小分離,電泳方向,電泳,小分子,大分子,16,夾在兩塊玻璃板之間的凝膠,電泳緩沖液,電泳緩沖液,加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品,分子量小,分子量大,電源,17,電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后的凝膠照片,18,5.2.5實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1）形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：丙烯酰胺、線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。（2）TEMED中混有氧化試劑后其自身極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。（3）過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時(shí)過硫酸銨不易過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠)。,19,（4）激活劑的用量:激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變得脆弱而失去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時(shí)，聚合鏈長度過短，將不會形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。（5）溫度的影響：聚膠的最佳溫度為2325，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有時(shí)從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時(shí)仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時(shí)快。（6）氧氣的影響：氧氣會與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度(125torr)脫氣至少15min。（7）凝膠添加劑：凝膠中常常加入SDS、尿素、TritonX-100等添加劑。SDS加入后不會對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。,20,（8）聚膠時(shí)間：雖然應(yīng)用過硫酸銨TEMED催化后灌膠1520min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90min才能保證95以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。采用核黃素時(shí)聚膠時(shí)間需更長，但它一般用于等電聚焦即根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)進(jìn)行分離，對孔徑大小要求不高，因此不必等很長時(shí)間(完全聚合需8h)。（9）單體的濃度：是指單體總重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可選擇的范圍為330，單體濃度增加后聚合速度將加快，因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。（10）SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。（11）有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。,21,5.2.6常見問題：（1）紋理和拖尾現(xiàn)象：由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。（2）蛋白帶過寬：與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。（3）電泳時(shí)間比正常要長：可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯(cuò)誤。（4）指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。（5）凝膠時(shí)間不對：通常膠在30min內(nèi)凝聚，如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS劑不夠或者失效。（6）出現(xiàn)“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。,22,（7）出現(xiàn)“鬼帶”如何處理：“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。（8）為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用：我們在實(shí)驗(yàn)中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。,23,5.3轉(zhuǎn)移電泳（Westernblot）,蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，凝膠所含的樣品蛋白質(zhì)區(qū)帶通過電泳方法轉(zhuǎn)移固定到具有一定韌性且化學(xué)惰性的高分子支持物（如尼龍膜、硝酸纖維素NC膜、聚偏氟乙烯PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽為抗原，與相應(yīng)的第一抗體和酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，用適當(dāng)?shù)娜芤浩慈ノ唇Y(jié)合抗體后，置含底物的溶液中培育，顯出譜帶，即可檢測出樣品中的特異蛋白（抗原）組分。,24,兩種常用的電轉(zhuǎn)移方法是濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn),兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置有所不同。濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽，然后加電壓。這是一種有效方法，但比較慢，需要大體積緩沖液，且只能用一種緩沖液。另外用這種方法轉(zhuǎn)移2-D電泳中常規(guī)使用的大膠比較困難。濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)一般在恒壓條件下進(jìn)行，轉(zhuǎn)移過程中，混合緩沖液保持電壓相對恒定。,25,半干轉(zhuǎn)移,半干轉(zhuǎn)移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因?yàn)殡姌O板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強(qiáng)度盡可能大，以便快速、有效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法又快（15-45分鐘）又好。多數(shù)半干轉(zhuǎn)移方法可以使用一種以上的緩沖系統(tǒng)，可以同時(shí)高效轉(zhuǎn)移大小不同的蛋白。然而，半干印跡系統(tǒng)因緩沖液較少不適于較長時(shí)間轉(zhuǎn)移。對于大2-D膠的印跡，半干轉(zhuǎn)移是理想選擇。半干印跡儀一般使用恒流條件，轉(zhuǎn)移過程中電壓逐漸增加。也可用恒壓條件（小于25V）。,26,實(shí)驗(yàn)操作流程圖,PAGE轉(zhuǎn)膜（PVDF或硝酸纖維素膜）封閉一抗洗滌酶標(biāo)二抗反應(yīng)洗滌顯色或化學(xué)發(fā)光顯影,27,28,Westernblot轉(zhuǎn)移膜的選擇,1.孔徑的選擇:通常當(dāng)目標(biāo)分子量小于20kD時(shí)，采用孔徑為0.22um的膜。一般用0.45um孔徑。2.膜材料的選擇1）硝酸纖維素膜(NC)：純度很重要，純度越高，結(jié)合蛋白越強(qiáng)。背景低，價(jià)格便宜。缺點(diǎn)是結(jié)合蛋白量比PVDF膜低。2）PVDF膜：結(jié)合蛋白質(zhì)的量大，幾乎是NC膜的6倍。缺點(diǎn)是背景高，價(jià)格貴，操作麻煩。3）尼龍膜：結(jié)合蛋白的量大，缺點(diǎn)是：背景高，現(xiàn)在很少使用。3.不同膜轉(zhuǎn)移緩沖液的選擇：NC膜，SDS要少。,29,濕轉(zhuǎn)電泳,1）將轉(zhuǎn)移膜剪成和凝膠一樣大小。2）將PVDF膜在100%甲醇中均勻潤濕（約2-3秒），再在水中漂洗2-3min，然后在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少15min。3）電泳結(jié)束后，將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡5min。4）將凝膠置于也在緩沖液中浸泡過的Whatman3mm濾紙上，然后將PVDF膜覆于凝膠上，再蓋上一張浸濕的濾紙（避免在每一層間留有氣泡），最后將它們一起夾入轉(zhuǎn)移盒中。5）根據(jù)需要轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的分子量設(shè)定恒定工作電流及轉(zhuǎn)移時(shí)間，一般分子量20KD的蛋白質(zhì)從0.5mm厚的凝膠上轉(zhuǎn)移可設(shè)電壓50V，時(shí)間約需10-30min，分子量大的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移需要的時(shí)間相應(yīng)增加，但是在實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的分子量100KD時(shí)，即使轉(zhuǎn)移45-60min膜上吸附的蛋白質(zhì)的量仍不理想。另外，如果用Tris-甘氨酸緩沖液，電壓為40V，需1-4h。6）轉(zhuǎn)移完畢后將膜去下在超純水中漂洗23次，每次5min，以洗去膜上沾有的在電泳和電印跡過程中使用的緩沖液。如果用做氨基酸分析：轉(zhuǎn)移緩沖液首選CAPS，這是因?yàn)镃APS對以后的氨基酸組成分析、蛋白質(zhì)序列測定影響小，另外CAPS在pH11時(shí)有很好的緩沖能力，并保證絕大多數(shù)蛋白