Part補(bǔ)體參與的反應(yīng)PartT細(xì)胞數(shù)量及其功能檢測(cè),實(shí)驗(yàn)三,免疫學(xué)教研室王麗娜Email：myx,補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體的溶血反應(yīng)-免疫血清的制備與應(yīng)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)T細(xì)胞及其功能檢測(cè)E花環(huán)形成試驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：形態(tài)學(xué)方法3HTDR摻入法MTT比色法T細(xì)胞亞群檢測(cè)：間接免疫熒光法免疫組化法-SABCAP法,主要內(nèi)容,補(bǔ)體激活的三條途徑,經(jīng)典途徑,MBL途徑,旁路途徑,IC+C1q,MBL+病原體配基,細(xì)菌+C3,膜攻擊復(fù)合物,細(xì)胞溶解,Part補(bǔ)體參與的反應(yīng),思考題,材料：綿羊紅細(xì)胞、補(bǔ)體、免疫血清（自制）問(wèn)題：請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)闼苽涞拿庖哐宓奶禺愋裕?1、補(bǔ)體的溶血反應(yīng)-補(bǔ)體參與的反應(yīng),原理綿羊紅細(xì)胞（SRBC）作為抗原與其相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合后，通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，產(chǎn)生膜攻擊作用，最后導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，發(fā)生溶血反應(yīng)。,實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果判斷,陽(yáng)性,不溶血,反應(yīng)系統(tǒng),指示系統(tǒng),溶血反應(yīng),補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),補(bǔ)體,2、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)-補(bǔ)體參與的反應(yīng),原理,反應(yīng)體系與結(jié)果判斷,否,是,是,是,否,羊紅細(xì)胞對(duì)照,PartT細(xì)胞數(shù)量及其功能檢測(cè),1.E花環(huán)形成試驗(yàn),原理人外周血T細(xì)胞表面具有天然的能與綿羊紅細(xì)胞(SRBC)表面糖肽相結(jié)合的受體（E受體），可結(jié)合SRBC形成花環(huán)樣細(xì)胞團(tuán)。因?yàn)門(mén)細(xì)胞的異質(zhì)性，它們對(duì)綿羊紅細(xì)胞的親和力不同，所以T細(xì)胞可以形成不同類(lèi)型的E花環(huán)，如EtRFC（總花環(huán)）、EaRFC（活性花環(huán)）、EsRFC（穩(wěn)定性花環(huán)）等。,檢測(cè)T細(xì)胞數(shù)量，間接判斷機(jī)體的細(xì)胞免疫狀況。,CD2,實(shí)驗(yàn)器材肝素抗凝血、綿羊紅細(xì)胞（SRBC）淋巴細(xì)胞分層液、Hanks液、1640培養(yǎng)液、0.5戊二醛固定液、燦爛甲酚蘭染液試管、滴管、離心機(jī)、微量移液器、玻片、顯微鏡等,實(shí)驗(yàn)步驟,密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞：取稀釋好的人外周血，用滴管貼管壁（傾斜30）輕輕疊加于2ml分離液上（界面要清晰）配平后2000rpm離心10mins。離心后分為5層，由上8而下分別為：稀釋的血漿、單個(gè)核細(xì)胞、分離液、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞。,1.淋巴細(xì)胞懸液的制備：,動(dòng)作輕柔；分清滴管及槍頭！,稀釋的血漿單個(gè)核細(xì)胞分層液粒細(xì)胞紅細(xì)胞,離心后,洗滌細(xì)胞：另取一支滴管，仔細(xì)吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個(gè)核細(xì)胞，放入盛有5mlHanks液的試管2000rpm離心5mins。棄上清（傾倒時(shí)液體不要回流），將沉淀的淋巴細(xì)胞輕彈混勻后加入Hanks液5ml，重復(fù)離心一次。2.棄去上清，留經(jīng)過(guò)洗滌的淋巴細(xì)胞懸液0.1ml與綿羊紅細(xì)胞0.1ml、1640營(yíng)養(yǎng)液0.1ml混合輕彈混勻后放于37溫箱15mins。,3.取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢）室溫靜置3-5分鐘。4.取出試管，吸去半量上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5.取25ul液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。6.顯微鏡下觀察。,E花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)（燦爛甲酚蘭染色，400）,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,高倍鏡下觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算花環(huán)形成率。淋巴細(xì)胞上結(jié)合3個(gè)SRBC者為E花環(huán)陽(yáng)性。,正常參考值：EtRFC：64.46.7；EaRFC：23.63.5；EsRFC：3.32.6,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,2.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),原理T細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細(xì)胞體積增大并能進(jìn)行分裂的淋巴母細(xì)胞，稱(chēng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，故可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)。常用方法形態(tài)學(xué)方法3H-TDR摻入法MTT比色法,胞核的大小、與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造與核仁的有無(wú)成熟小淋巴細(xì)胞：核染色深、沒(méi)有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；淋巴母細(xì)胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁1-2個(gè)，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細(xì)胞：中性粒細(xì)胞在培養(yǎng)72小時(shí)后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。,(1)形態(tài)學(xué)方法-淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),鏡下結(jié)果,紅細(xì)胞,未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞,轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)瑞氏染色10100,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,正常參考值：80,3H-TDR摻入法-淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),T細(xì)胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細(xì)胞進(jìn)入S期，此時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR），可以被細(xì)胞攝入而摻入DNA中，通過(guò)-液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定3H-TDR的摻入量，判斷細(xì)胞的增殖程度。,MTT比色法-淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),MTT為一種黃色可溶性物質(zhì)，細(xì)胞活化增殖時(shí)通過(guò)線粒體能量代謝，將MTT代謝成藍(lán)紫色的甲臢，沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周?chē)纬杉着N的量與細(xì)胞活化增殖的程度呈正比。甲臢經(jīng)鹽酸異丙醇溶解后呈紫藍(lán)色，置于酶標(biāo)儀下根據(jù)顯色程度即可知道甲臢量并反映細(xì)胞活化程度。,MTT,Formazan,Insoluble,細(xì)胞上的CD分子相應(yīng)鼠抗人單克隆抗體兔抗鼠IgG熒光抗體反復(fù)洗滌，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。,間接免疫熒光法,3.T細(xì)胞亞群檢測(cè),間接SABC-AP法,SABC：鏈霉親合素生物素復(fù)合物AP：堿性磷酸酶生物素活化后可以標(biāo)記抗體和酶，且不影響它們的活性；鏈霉親合素同一定濃度的生物素、酶混合后，就能形成鏈霉親合素(SA)-生物素(B)-酶(E)復(fù)合物(SAB-EC)。這種復(fù)合物中至少存在一個(gè)尚未被生物素占據(jù)的親合素結(jié)合位點(diǎn)，可與生物素標(biāo)記抗體結(jié)合。,3.T細(xì)胞亞群檢測(cè),基本過(guò)程,間接SABC-AP法-T細(xì)胞亞群檢測(cè),T細(xì)胞亞群檢測(cè)（免疫組化，400）,補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體的溶血反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)T細(xì)胞數(shù)量及其功能檢測(cè)數(shù)量檢測(cè)E花環(huán)形成試驗(yàn)T細(xì)胞亞群檢測(cè)：間接免疫熒光法免疫組化法-SABCAP法功能檢測(cè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：形態(tài)學(xué)方法3HTDR摻入法MTT比色法,小結(jié),綜合性實(shí)驗(yàn)免疫血清制備及應(yīng)用,不但要注意實(shí)驗(yàn)怎么做，還要知道該試驗(yàn)的用途。,溶血反應(yīng)的原理、步驟、結(jié)