基因工程GeneticEngineering 目錄 重組DNA技術(shù) DNARecombinationTechnique 重組DNA技術(shù)的發(fā)展史 年G J Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O T Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司 專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物 1980年開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉 相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系 本節(jié)主要內(nèi)容 一 重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 克隆 clone 來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合 獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化 cloning 即無(wú)性繁殖 一 DNA克隆 技術(shù)水平 分子克隆 molecularclone 即DNA克隆細(xì)胞克隆個(gè)體克隆 動(dòng)物或植物 DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法 在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì) 同源的或異源的 原核的或真核的 天然的或人工的DNA 與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子 復(fù)制子 replicon 繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞 再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子 也稱基因克隆或重組DNA recombinantDNA 生物技術(shù)工程 基因工程 蛋白質(zhì)工程 酶工程 細(xì)胞工程等 目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物 蛋白質(zhì) 基因工程 geneticengineering 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程 又稱重組DNA工藝學(xué) 二 工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶TaqDNA聚合酶 重組DNA技術(shù)中常用的工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 定義限制性核酸內(nèi)切酶 restrictionendonuclease RE 是識(shí)別DNA的特異序列 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶 BamH 作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) 限制外源DNA 保護(hù)自身DNA 分類 基因工程技術(shù)中常用 型 第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名 用大寫 第二 第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名 用小寫 第四個(gè)字母代表株 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序 命名 Hind Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu) palindrome 切口 平端切口 粘端切口 BamH Hind 平端切口 粘端切口 同功異源酶來(lái)源不同的限制酶 但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn) 這些酶稱同功異源酶 BamH Bst 同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同 但切割DNA后 產(chǎn)生相同的粘性末端 稱為同尾酶 這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端 compatibleend BamH Bgl 三 目的基因 cDNA complementaryDNA 基因組DNA genomicDNA 四 基因載體 定義為攜帶目的基因 實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子 常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA 克隆載體 cloningvector 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體 表達(dá)載體 expressionvector 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 能自主復(fù)制 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物 便于重組體的篩選和鑒定 有克隆位點(diǎn) 外源DNA插入點(diǎn) 常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn) 稱為多克隆位點(diǎn) 分子量小 以容納較大的外源DNA 1 質(zhì)粒 plasmid 特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制 帶有某些遺傳信息 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 目錄 噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列 插入型 適用cDNA克隆 EMBL系列 置換型 適用基因組克隆 2 噬菌體 phage M13噬菌體DNA改造系統(tǒng) 含lacZ基因 M13mp系列pUC系列 3 粘性質(zhì)粒 cosmid 酵母人工染色體 yeastartificialchromosome YAC 細(xì)菌人工染色體 bacterialartificialchromosome BAC 動(dòng)物病毒DNA改造的載體 如腺病毒 腺病毒相關(guān)病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒 其他 二 重組DNA技術(shù)基本原理 以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過(guò)程 目錄 一 目的基因的獲取 1 化學(xué)合成法要求 已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 2 基因組DNA文庫(kù) genomicDNAlibrary 3 cDNA文庫(kù) cDNAlibrary 4 聚合酶鏈反應(yīng) polymerasechainreaction PCR 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列 組織或細(xì)胞染色體DNA 基因片斷 克隆載體 重組DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合 從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因 目錄 目錄 目錄 體內(nèi)DNA的復(fù)制 復(fù)習(xí) PCR擴(kuò)增原理 引物 5 5 3 3 三 外源基因與載體的連接 1 粘性末端連接方式 1 同一限制酶切位點(diǎn)連接 2 不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接 二 克隆載體的選擇和構(gòu)建 BamH 切割反應(yīng) T4DNA連接酶15 C 同一限制酶切位點(diǎn)連接 目錄 不同限制酶切位點(diǎn) 非配伍末端 的連接 EcoR 切割位點(diǎn) Bgl 切割位點(diǎn) 配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似 目錄 2 平端連接適用于 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端 目錄 3 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶 terminaltransferase 的作用下 在DNA片段末端加上同聚物序列 制造出粘性末端 再進(jìn)行粘端連接 載體DNA 目的基因 限制酶或機(jī)械剪切 限制酶 目錄 4 人工接頭 linker 連接由平端加上新的酶切位點(diǎn) 再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端 而進(jìn)行粘端連接 人工接頭及其應(yīng)用 目錄 受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài) competent 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 transformation 轉(zhuǎn)染 transfection 感染 infection 四 重組DNA導(dǎo)入受體菌 五 重組體的篩選1 直接選擇法 1 抗藥性標(biāo)記選擇 2 標(biāo)志補(bǔ)救 markerrescue 3 分子雜交法原位雜交Southern印跡2 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等 插入失活法 抗藥性標(biāo)記選擇 目錄 組氨酸缺陷型大腸桿菌 無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基 酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因 促進(jìn)組氨酸合成 DNA 重組體 標(biāo)志補(bǔ)救 目錄 互補(bǔ) 目錄 互補(bǔ)的檢測(cè) 目錄 原位雜交 目錄 Southern印跡 目錄 雞的 肌球蛋白的克隆和檢出 目錄 重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為 小結(jié) 重組DNA技術(shù)操作的主要步驟 目錄 表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 六 克隆基因的表達(dá) 1 原核表達(dá)體系 E coli表達(dá)體系最為常用 標(biāo)準(zhǔn) 選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)E coli表達(dá)體系的不足不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 inclusionbody 很難表達(dá)大量可溶性蛋白 大鼠胰島素原cDNA的表達(dá)和分泌 目錄 優(yōu)點(diǎn) 可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn) 操作技術(shù)難 費(fèi)時(shí) 經(jīng)濟(jì) 轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程 方法 磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射 2 真核表達(dá)體系酵母 昆蟲 乳類動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)載體pFASTBACI的物理圖譜 目錄 目錄 一 疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì) 而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制 三 重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系 二 生物制藥 重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 目錄 基因診斷 geneticdiagnosis 是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理 在DNA水平分析 鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換 缺失或插入等突變 三 基因診斷 基本過(guò)程 區(qū)分或鑒定DNA的異常 分離 擴(kuò)增待測(cè)的DNA片斷 標(biāo)準(zhǔn) 能正確擴(kuò)增靶基因 能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別 本底或噪聲低 不干擾DNA的鑒定 便于完全自動(dòng)化操作