密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 I 摘 要 對 本項目組 現(xiàn)有菌種資源進行提純復壯，采用透明圈法和發(fā)酵液 實效 酶活力比較法， 篩選出高產(chǎn) 歐文氏桿菌變異 菌株 采用單因子和多因子相結合的統(tǒng)計方法，獲得該菌株最佳生長培養(yǎng)基配方 ： 萄糖、 芋精粉、 肉膏、 母膏和 白胨；適宜 發(fā)酵培養(yǎng)基配方： 芋精粉、 肉膏、 母膏、 白胨和 采用 對該菌株 果表明：適宜條件下培養(yǎng) 9h 出現(xiàn)產(chǎn)酶高峰，發(fā)酵液粗酶活力達 3050U/應 為 適 反應 溫度為 65 ，最適底物為 2mg/芋膠，緩沖液為 檸檬酸 磷酸氫二鈉。 采用超濾和凝膠柱層析對 泌的 果表明： 超濾分離合適的膜包孔徑為 10 50濃縮倍數(shù)可達 活力總回收率為 蛋白質純化倍數(shù)為 10； 膠柱層析從超濾濃縮液中分離出 13 個蛋白質峰，其中僅 1 個具有酶活力； 泳檢測出單一優(yōu)勢帶。由此說明，采用膜分離技術加層析方法這樣一個簡單流程即可獲得單質 對純化的 果表明： 量為 定 為 穩(wěn)定溫度范圍在 70 以下； 1 的 、 、 、 同濃度的 槐豆膠為底物時， m 和 別為 2000以魔芋膠為底物時， 別為 關鍵詞： 歐文氏桿菌， 透明圈，酶學性質，分離純化 y to of in in of in of By it is 050U/it h in is pH 5 , mg/ml By as 0 50, of 0. 13 of is be by a to By as 8.2 pH is 0 . is by is m m ml 000 is m m ml 錄 第一章 緒論 . . 1 究的目的和意義 . 1 露聚糖 . 1 . 1 . 2 . 2 . 3 . 3 內外有關 . 4 . 4 . 4 . 4 . 5 . 5 . 7 . 7 定及測定 . 8 第二章 研究內容 . . 9 驗方法和材料 . 9 株 . 9 要儀器 . 9 要化學試劑 . 10 要溶液 . 10 養(yǎng)基 . 12 驗方法 . 12 種培養(yǎng)流程 . 12 長培養(yǎng)基優(yōu)化 . 12 酵培養(yǎng)基優(yōu)化 . 13 酶液制備 . 13 萄糖標準曲線制作 . 13 露糖標準曲線制作 . 14 . 14 白質標準曲線制作 . 15 . 16 析 . 16 . 17 . 17 驗結果與分析 . 18 甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株篩選 . 18 養(yǎng)基優(yōu)化 . 19 長培養(yǎng)基優(yōu)化 . 19 酵培養(yǎng)基優(yōu)化 . 19 . 21 活力測定體系優(yōu)化 . 21 物濃度對酶促反應的影響 . 21 . 22 度對酶促反應的影響 . 22 . 23 白酶抑制劑的選擇 . 23 活力及蛋白質含量測定法檢驗超濾效果 . 23 泳法檢驗超濾效果 . 24 膠層析分離蛋白質 . 25 . 27 . 27 . 27 . 27 屬離子對 . 28 m 和 . 28 第三章 討論 . . 30 酶的生產(chǎn)效率評價 . 30 濾條件的選擇 . 30 . 30 第 四 章 結論 . . 32 參考文獻 . . 33 致謝 . . .者簡歷 . V 英文縮略表 (英文縮寫 英文全稱 中文名稱 硫酸銨 烯酰胺 析純試劑 亞甲基雙丙烯酰胺 文氏桿菌系列 補 米 硫蘇糖醇 ,5二胺四乙酸鈉鹽 g of 力加速度的倍數(shù) g h 時 際酶活力單位 道爾頓 氏常 數(shù) 芋葡 甘 聚糖 克 升 對遷移率 r 對分子量 露聚糖酶基因 豆膠 密度 丙烯酰胺凝膠電泳 甲基磺酰氟 分鐘轉速 對離心力 s S 物 S of 物濃度 二烷基磺酸鈉 ,N,N,N羥甲基氨基甲烷 U 活力單位 V 積 Vm of 大反應速率 W 量 摩爾 l 升 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 究的目的和意義 露聚糖 甘露聚糖（ 一類以 4線狀多糖。如果主鏈的某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過 6稱之為異甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖 (葡萄甘露聚糖 (半乳葡萄甘露聚糖(龍健兒， 1998）。 甘露聚糖廣泛存在于植物中，其中魔芋、蘆薈、馬鈴薯（馬冰潔等， 2006）、番茄（ 2000）、椰子殼 （ 黃廣明等， 2001） 、咖啡、長豆角、皂莢豆、槐豆角種子等甘露聚糖含量較高。 不同植物的甘露糖種類及含量有很大差異。如：皂莢豆的內胚乳中含有 半乳甘露聚糖 ， 主鏈是以 -(1， 4)鏈是以 -(1， 6)乳糖與甘露糖配比為 1:蔣建新等， 2003） ；田菁膠的甘露聚糖分子主鏈是 苷鍵連接的甘露糖，并含有 6糖苷鍵連接的半乳糖側鏈，甘露糖與半乳糖之比為 2:1；瓜爾膠中以聚甘露糖為分子主鏈， 4苷鍵連接，甘露糖與半乳糖單元之摩爾比為 2:1；香豆膠主鏈是 1， 4相連的 露糖，支鏈為 1， 6相連的 乳糖和甘露糖的比值為 1:敏等， 2003；蔣建新等， 2005）；魔芋膠由 :2比例，通過 3苷鍵結合而成（王成軍等， 2006）。同種植物中的甘露聚糖結構殘基也不一致，庫拉索蘆薈中含有兩種酸性多糖 糖 摩爾比為 1:糖 吉昌等， 2003）。 異甘露聚糖依據(jù)其結構，基本可分成兩類：一類為半乳甘露聚糖，其主鏈為同質 4鏈為 6：槐豆膠、瓜兒豆膠、田菁膠等）；另一類為葡萄甘露聚糖，其主鏈為 4量 4鏈為 6：魔芋膠）。 甘露聚糖是一類結構比較穩(wěn)定，普通方法難以去除的物質。傳統(tǒng)工業(yè)中，采用強酸、強堿、高溫、高壓等極端條件才能去除。這不僅易造成環(huán)境污染，還會增加生產(chǎn)成本。隨著生物技術的飛速發(fā)展，這個過程可以由一系列酶來完成。降解甘露聚糖主要依靠 是一類能夠水解含有 4露多糖，生成甘露二糖、三糖等小分子物質的水解酶。但要徹底降解甘露聚糖，還需要甘露糖苷酶（ 半乳糖苷酶 （ 、葡萄糖苷酶 （ 、乙酰甘露聚糖脂酶 （ 等支鏈酶的協(xié)同作用（張運雄， 2006）。 目前甘露聚糖酶及其水解產(chǎn)物已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥 、飼料、造紙、印染、紡織、石油開采及生物研究技術等領域。例如 :作為工具酶對天然多糖的糖鏈結構進行分析，因為復雜糖類或中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 糖蛋白的糖鏈中常有 用 測定水解產(chǎn)物中寡糖類物質的種類和比例，從而可推知其多糖結構；在造紙工業(yè)中，用酶法代替堿法除去紙漿中的半纖維素，以起到脫色和漂白的作用；在紡織工業(yè)中用作天然纖維原料中半纖維素等膠質的降解，以取代常規(guī)的化學法脫膠工藝，并能有效地去除紡織印染產(chǎn)品上粘附的多余染料，可減少對環(huán)境的污染；在保健食品和醫(yī)藥方面，利用 水解含甘露聚糖來源豐富的植物（如角豆膠、瓜兒豆膠、魔芋粉等）生成含有不同單分子（ 2 10 個）組成的甘露低聚糖，具有有效降低人體膽固醇水平、減輕便秘、降低血糖、增加腸內有益菌和減少有害菌的生理功能；在飼料工業(yè)中用作飼料酶添加劑，起到消除抗營養(yǎng)營養(yǎng)因子的作用；此外， 優(yōu)質生物破膠劑，具有效率高、成本低、對地層傷害小等優(yōu)點（李希明， 2006）。 從上世紀 90年代以來，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究引起人們極大關注。 甘露聚糖生成單糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖。這些低聚糖為功能性糖類，在胃腸中不能被消化，但可以被人體和動物體腸道中有益細菌吸收，由此改善腸道內菌群組成，增進消化系統(tǒng)功能。所以在食品中添加一定量的 降低營養(yǎng)物質在腸道內的蓄積，改變有害菌繁殖的環(huán)境，減少腸道內有害微生物，使腸壁變薄，改善營養(yǎng)物質的消化吸收。 甘露低聚糖是一種水溶性膳食纖維，能降低血清膽 固 醇和三脂酰甘油的含量 。 攝 入 甘露低聚糖后不會引起血糖水平的波動，因此可作為高血壓、糖尿病和肥胖癥患者用甜昧劑。甘露低聚糖是一種防齲齒、低腐蝕性的 功能性甜昧劑，它不能被鏈球菌發(fā)酵生成不溶性葡聚糖，從而使得口腔微生物缺少沉積、產(chǎn)酸和腐蝕的場所（張升暉等， 2005；馬俊等， 2006；龍德清等， 2003；李堅， 2005；孫沈魯?shù)龋?2003；向進樂等， 2004）。 甘露聚糖是植物性飼料原料中除纖維素、木聚糖之外，分布最廣泛、含量最高的一類半纖維素，而且在一些植物 (如魔芋 、 田菁 、槐豆 等 )中有如淀粉樣的大量積累。甘露聚糖也是豆科植物種子和酵母細胞壁的主要成分。這類原料用甘露聚糖酶處理，可以生產(chǎn)高品質的甘露寡糖產(chǎn)品。飼料原料中含有這類原料時，由于畜禽和魚類的消化酶系中不含甘露聚糖酶，對這類物質的轉化利用需要添加外源酶（呂松喬， 2004；丁宏標， 2004）。 玉米 /豆粕型日糧是我國豬雞的主要日糧，其重要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。大豆多糖溶漲后可吸收自身重量七倍的水，并吸附多種微量元素。因其在單胃動物的消化道內呈凝膠狀，使消化道內容物具有較強的粘性，從而影響營養(yǎng)物質的吸收，并導致畜禽不同程度的拉稀，最終影響畜禽的生長與飼料利用率。 豆粕型日糧最有效的飼用酶制劑之一，可降解其含有的抗消化粘性多糖，消除 抗營養(yǎng)因子，提高飼料利用率。 此外， 夠改善 畜禽腸道微生物菌群和提高腸道粘膜完整性，提高畜禽的抵抗力。這些 甘露寡糖是飼用抗生素最具競爭力的替代品。它沒有抗藥性，沒有藥物殘留，是我國畜禽水產(chǎn)品出口，和加入 有良好的應用價值。人們對其的興趣與日俱增（張曉軍等， 2005；喬新君等， 2006；李興鳴等， 2006）。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 最近，美國科技人員進行試驗，測定了添加 大豆日糧產(chǎn)蛋母雞性能的影響。結果表明， 在日糧中添加 31 42周提高 43 54周提高 55 66周提高 從 66周平均提高 趙國琦等（ 2002）研究了在蛋雞日糧中添加不同水平的 現(xiàn)添加一定水平的由細菌 以獲得高于添加桿菌肽鋅產(chǎn)蛋性能及其抗病力。 苧麻原料的主要組成為纖維素，其 它 化學組成還有果膠、半纖維素和木質素，麻紡行 業(yè)稱為膠質，為了得到苧麻可紡纖維，必須首先脫膠。傳統(tǒng)的脫膠工藝都是以燒堿煮煉為核心的化學脫膠，纖維可紡性能劣化，對環(huán)境的污染非常嚴重。近代生物技術的發(fā)展，為苧麻脫膠展示了一條全新的道路，即用生物脫膠。生物脫膠的主要方法有：在原麻中加菌或直接添加酶制劑兩種。但兩種方法歸根結底都是生物酶作用于膠質，其中甘露聚糖酶就是關鍵酶之一。中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所劉正初研究員等人早在上個世紀 80年代就篩選出高效脫膠菌 對苧麻生物脫膠機理進行研究（張運雄等， 2001）。隨后麻類生物脫膠逐漸成為熱門話題（劉喚明 等， 2006；劉自镕等， 2001；李德舜等， 2006）。 煙草中有相當數(shù)量的植物淀粉類物質和膠質。這些大分子多糖和膠質吸濕性強，不僅影響煙葉的燃燒性，還會產(chǎn)生甲醇，給煙氣帶來刺激性，污染環(huán)境。工業(yè)生產(chǎn)中，采用微波處理煙梗，同時添加外源甘露聚糖酶，可以經(jīng)濟有效地控制煙草膠質含量，為煙草質量控制提供有效方法（劉燕等， 2006）。 列菌株的特點 列菌株（包括 中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究 所劉正初等采用基因工程手段，將編號為 株的質粒轉化到 個 編號為 株，而獲得的一系列歐文氏桿菌變異菌株。它們可以分泌 30多種胞外酶，其中以果膠酶、木聚糖酶，甘露聚糖酶含量最高，對麻類脫膠有著非常顯著的效果。該系列菌株能在 8h 內完成苧麻、亞麻、羅布麻、紅麻等的脫膠過程，得到松散、柔軟，可以制作高檔服飾的天然纖維。該系列菌株用于麻類脫膠生產(chǎn)工藝具有高產(chǎn)、優(yōu)質、高效、節(jié)能、低污染等優(yōu)點，由此表現(xiàn)出來的 “ 廣譜性 ” 和 “ 高效性 ” 實屬國內外罕見 。 此前，潭秀山 （ 2004） 對 膠酶活性等進行了研究；李寶坤（ 2005）對 不同碳源條件下分泌 且對 運雄（ 2006）研究了 效提取草本纖維的機理，并克隆了甘露聚糖酶基因。但是，至今未見系統(tǒng)比較 列菌株分泌 本研究的目的在于 通過 系統(tǒng)比較 列菌株產(chǎn) 篩選出 高產(chǎn) 而優(yōu)化其產(chǎn) 究其產(chǎn) 建立相應的究 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 內外有關 國內外對 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化 、 酶的分離純化和 特性研究、基因克隆與重組表達以及甘露寡糖的酶法生產(chǎn)等方面。 1960 年以來國際上開始有關于 要應用于多糖結構分析。 1980 年我國李欣等首次系統(tǒng)研究甘露聚糖的化學組成。 1985 年以后，隨著 關研究競爭顯著加劇， 有關 基礎研究和工業(yè)應用進展相當迅速。 些動物如：藍貝、海洋軟體動物短濱螺 、 亮大蝸牛等都能產(chǎn) 某些豆類植物 （ 例如 ： 長角豆 、 瓜兒豆等 ） 發(fā)芽的種子 、 魔芋球莖 （ 史益敏等， 1990；杜先鋒等， 2000） 、南歐紫荊 （ 陶樂平， 1995） 、番茄 （ 王傲雪， 2006）、 萵苣（ 1997） ，黃檜 （ 2000） 等都發(fā)現(xiàn)了 微生 物包括真菌、細菌 、 放線菌等是 已報道的微生物有：細菌中的芽孢桿菌，如嗜堿芽孢桿菌 (楊清香， 1998）、地衣芽孢桿菌 (彭愛銘等， 2004；張峻等， 2000）、 短小芽孢桿菌 ( 1990）及枯草芽孢桿菌 (崔福綿等， 1999），卵形擬桿菌 ( 1987），熱纖梭菌 ( 1981） ，纖維單胞菌 ( 1999） ；真菌中的真菌齊整小核菌 ( 1998） ，曲霉如黑曲霉 (李劍芳等， 2006；朱劼， 2005）、米曲霉 （ A. ，木霉中的里氏木霉 (程池等， 2004；王和平等， 2003）、綠色木霉 ( 1978）；放線菌中的諾卡氏菌形放線菌 (吳襟， 2000）等。 育 微生物來源的 本低，來源穩(wěn)定，提取方便以及比動植物更廣的作用 度范圍和底物專一性等顯著特點，易被理論研究和工業(yè)化生產(chǎn)應用。要得到大量 育優(yōu)良菌株是關鍵。 楊幼惠等（ 2001）利用剛果紅平板篩選法從芽孢桿 菌屬中篩選到產(chǎn) 后羅強等（ 2003）利用離子注入和紫外線復合誘變 采用 “系統(tǒng)全而反饋實驗優(yōu)化技術 ”優(yōu)化了發(fā)酵條件。蒙海林等（ 2006）以魔芋、番鬼芋、土壤、海水等從自然界采集到的樣品為實驗材料，經(jīng)過搖瓶初篩、復篩，選出一株酶活 力 最高的菌株，再對該菌株進行 過分離、平板水解圈初篩和搖瓶復篩，得到一株優(yōu)良變異菌，其酶活 力 是出發(fā)菌株的 2倍。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5 發(fā) 酵 條件優(yōu)化 大量研究資料表明，不同微生物產(chǎn) 表 1但絕大部分微生物的 有在培養(yǎng)基中添加甘露聚糖（如魔芋粉 、 槐豆膠 、瓜兒豆膠 等 )時才進行合成。產(chǎn)酶培養(yǎng)基常用的碳源有角豆膠、魔芋粉、槐豆膠等，氮源有豆餅粉、蛋白陳、酵母膏、谷氨酸鈉、麩皮等。不同微生物合成 些嗜堿性細菌要求較高的 延和等， 1991）；一些黑曲霉需要特定金屬離子（李劍芳等， 2002）。 表 1分微生物產(chǎn) 糖酶的條件 of 菌 株 碳 源 氮 源 溫度 ( ) 培養(yǎng)時間 (h) 參考文獻 10 魔芋精粉 魔芋飛粉 7 24 熊郃等， 2004 芋粉 酵母粉 、 2 34 60 陳一平等， 1999 芋粉 酵母膏、 (0 25 楊新建等，2006 Y 34 魔芋粉 麩皮 0 120 江正強等，2006 芋粉 牛肉膏、酵母膏 5 36 崔福綿等，1999 Y 45 魔芋粉 大豆蛋白胨 0 96 江正強等，2005 豆膠 谷氨酸鈉 10 32 48 馬延和等，2001 豆膠 蛋白胨、牛肉膏 37 36 楊清香等，1998 芋粉 麩皮、 (35 96 李江華等，2002 芋粉 豆餅粉 311 84 李劍芳等，2002 接種量、通氣量、攪拌速度等對 據(jù)馬 延 和等（ 1992）對堿性 6 8 培養(yǎng)基營養(yǎng)物質充足的情況下，酶的合成與菌體生長密切相關，當菌體生長到對數(shù)末期時，酶的合成速度開始減慢，酶活性在 36 逐漸降低。溶氧水平直接影響好氧菌的菌體生長和產(chǎn)酶，高溶氧有利于菌體生長，而低溶氧有利于酶的合成。 另外，發(fā)酵罐的攪拌速度還直接影響底物的混合效果，從而影響發(fā)酵產(chǎn)酶，特別是以植物膠為碳源，培養(yǎng)基較粘稠，底物的混合程度尤為重要。 不同微生物所產(chǎn) 子量、 作用范圍、等電點、酶動力學常數(shù)、底物專一性等都有一定差異（見表 1 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 6 表 1生物 生物種類 溫度的影響 的影響 屬離子的影響 mg/ 分子量 參考文獻 羅爾阿太菌 最適反應溫度 30 ；不超過 50 時酶活穩(wěn)定 最適 定范圍 金 屬離子 、 、 能強烈抑制該酶活性；而 對該酶有部分的抑制作用；低濃度的 、 對該酶活無影響 42體蛋白 ) 劉洪燦等，2006 宇佐美曲霉 角豆膠為底物， 667 40 42 單體蛋白 ) 李劍芳等，2006 黑曲霉適溫度為 45 ，在50 和 60 恒溫水浴中存放 160 ，酶活力無明顯變化 最適 角豆膠為底物， 皮雄娥等，2006 地衣芽孢桿菌 適反應溫度為 60 ；不超過 40 時酶活穩(wěn)定 最適 定范圍 該酶有一定的激活作用；而 該酶有抑制作用 以魔芋膠和槐豆膠為底物， V 6 文博等，1995 枯草芽孢桿菌 適溫 度 70 ，在 50 保溫 4 60 ，4 70 的酶活半衰期為 3h 最適 范圍內穩(wěn)定 該酶有強烈的抑制作