密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小尾寒羊 因多態(tài)性 及 其 與 繁殖力關(guān)系 的研究 I 摘 要 家畜的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一 。 由于綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀遺傳力低（僅為 通過常規(guī)選擇方法難以提高，因此尋找控制排卵 數(shù)乃至產(chǎn)羔數(shù)的主效基因研究，已成為各國綿羊育種學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)。不同綿羊品種排卵率的遺傳變異為探討卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)理，研究基因控制排卵數(shù)提供了一個(gè)理想的模型，使得排卵數(shù)主效基因的鑒別成為可能。 本研究以轉(zhuǎn)化生長因子 1（ 生長分化因子 9（ 為小尾寒羊高繁殖力性狀的候選基因，對(duì)其進(jìn)行多態(tài)性分析，以探討這兩種細(xì)胞因子與綿羊繁殖性能的關(guān)系。試驗(yàn)選用小尾寒羊、灘羊、同羊、歐拉羊共計(jì) 196 頭為研究材料 ,采用 術(shù)分析不同綿羊品種 兩個(gè)基因的遺傳 變異 ,結(jié)果如下： 1、對(duì)綿羊 因 2 5、 6 7 外顯子間擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，在 6 7 外顯子區(qū)的 805 對(duì) 6 7 外顯子區(qū)進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果表明第 7 外顯子上游的第 294 位堿基處缺失了列 :的 14 201 位）。不同綿羊群體的基因型和基因頻率統(tǒng)計(jì)顯示 ,多胎品種小尾寒羊以 因型為主 ,單胎品種灘羊、同羊、歐拉羊以 因型為主， 屬于中度多態(tài) 。對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控元件及蛋白結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測，結(jié)果顯示 相比 B 型產(chǎn)生了三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白 )。小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均值關(guān)系為 3種基因型間差異不顯著（ P 2、對(duì)綿羊 因在其第 2 外顯子上設(shè)計(jì) 4 對(duì)引物分別擴(kuò)增進(jìn)行 析 ， 僅在引物 發(fā)現(xiàn)有多態(tài)位點(diǎn) 。 引物 小尾寒羊、灘羊、同羊、歐拉羊 4 個(gè)綿羊品種中都檢測到2 處堿基突變 (558 位 TC 和 692 位 TC)，表明在 4 個(gè)綿羊品種中均發(fā)生了新的 558 位 TC 和692 位 TC 位突變，該突變導(dǎo)致 231 位氨基酸異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸。該突變在 4 個(gè)綿羊品種中均為低度 多態(tài)。 因型小尾寒羊平均產(chǎn)羔數(shù)比 因型多 ，差異顯著（ AA an t P 4 to in in 2 TC 58 C 92) 2 a C 58 C 92 in 31 in an C 提前在 65水浴中預(yù)熱）到 中，室溫或 37 放置 2 分鐘， 第二章 材料與方法 21 12000心 1 分鐘，離心管中液體即為回收的 斷，可立即使用或保存于 備用 純化后的 別用 2%和 瓊脂糖凝膠檢測：取 2 3l 純化的 液與 1l 加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣（含 B） ,同時(shí)上樣一個(gè)相應(yīng)的 記。 化的 增 產(chǎn)物的克隆 隆用載體 由于在 增中， 大多在擴(kuò)增產(chǎn)物的 3。根據(jù)這一特性，本實(shí)驗(yàn)采用 司的 體以快速克隆 物。這種載體兩端特定地加上了一個(gè) T，這樣既可以防止載體地自身環(huán)化又為 物提供了配對(duì)堿基，從而有效地提高了克隆效率。 化的 物與載體的連接 計(jì)算插入片段與載體的量，即插入 載體的摩爾比。一般插入片段的分子摩爾數(shù)：載體分子摩爾數(shù) 3 8： 1，對(duì)大多數(shù)待克隆片段的連接均能得到較好 的實(shí)驗(yàn)效果。 純化的 段與 體在 （ 司 ，已包含有 接酶， 作用下 4 連接過夜。 連接反應(yīng)體系（ 10l） 體 1l 純化 物 4l 5l 4 連接 24h,取 10l 混合的連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 粒 小規(guī)模制備（堿裂解法） 挑取 板上得到的數(shù)個(gè)白色單菌落，分別接種于 5 100g/ 體培養(yǎng) 基中， 37 振蕩培養(yǎng) 8 12h,同時(shí)挑取一個(gè)藍(lán)色菌落作為陰性對(duì)照 吸取 1 菌培養(yǎng)液于 心管中， 120004 離心 5 棄上清，用滅菌的生理鹽水洗滌細(xì)菌沉淀兩次，每次盡量吸盡上清 加 100l 預(yù)冷的質(zhì)粒提取液 I 重懸菌體（充分混勻），冰浴 3 加 200 ，立即顛倒混勻至液體變得清亮，冰浴 5 再加入 150 ，冰浴 5 第二章 材料與方法 22 4 , 12000g 離心 5取上清 2 倍體積的 冰 乙醇沉淀質(zhì)粒 , 12000心 5上清 質(zhì)粒用 70%的乙醇洗滌兩次 ,除凈乙醇 37 烘干 ,加 50l 解 ,加 1l(終濃度為 20g/ 4 貯存 質(zhì)粒 酶切鑒定 酶切反應(yīng)體系 10l: 質(zhì)粒 3l 限制性內(nèi)切酶 5U 10限制性內(nèi)切酶用 1l 用高壓滅菌雙蒸水將體系補(bǔ)足為 10l 37 水浴消化 2h。 質(zhì)粒 序列測定 取經(jīng)鑒定，重組成功的陽性克隆 的菌液 1交上海生物 工程 有限公司進(jìn)行測序。 統(tǒng)計(jì)分析方法 因頻率和基因型頻率的計(jì)算 基因頻率 是指一個(gè)群體中某一基因?qū)ζ涞任换虻南鄬?duì)比率 2(+(,與 i 共顯的第 1 到 n 個(gè)等位基因 基因型頻率 是指一個(gè)群體中某一性狀的各種基因型之間的比率 基因型頻率 =基因型個(gè)體數(shù) /測定群體總數(shù) 因和基因型頻率的差異顯著性檢 驗(yàn) ( 首先根據(jù)基因頻率計(jì)算各種基因型頻率的理論值，然后計(jì)算 2 值。由于本研究資料的自由度，某些基因型的理論次數(shù)小于 5，因此采用矯正公式： 第二章 材料與方法 23 i 論值 際觀察值 n:等位基因數(shù) 矯正后的公式為： 論值 際觀察值 n:等位基因數(shù) 羊 因的遺傳多態(tài)性分析 4 個(gè) 品種 綿羊 群體 衡狀態(tài)的檢測 衡是指在一個(gè)無窮大或足夠大規(guī)模的，封閉的，隨機(jī)交配的孟德爾群體中，基因頻率和基因型頻率在世代交替過程中保持穩(wěn)定不變。而且，基因頻率和基因型頻率間存在簡單關(guān)系。 綿羊 因的雜合度，有效等位基因數(shù)以及多態(tài)信息含量的計(jì)算 1、 遺傳純合度（ :某一群體中一個(gè)特定的基因位點(diǎn)上等位基因純合的純度。 2、 遺傳雜合度（ :與純合度相對(duì) 3、 有效等位基因數(shù)（ of :純合度的倒數(shù)，反應(yīng) 等位基因間的相互影響，是衡量基因純合度的又一指標(biāo)。 4、 多態(tài)信息含量（ 用于對(duì)標(biāo)記基因多態(tài)性的 估計(jì)。 高度多態(tài)， 中度多態(tài)， 低度多態(tài)。 mi mi C 1 11 1 222 21 別為第 i 和第 j 個(gè)等位基因在群體中的頻率， m 為等位基因數(shù)。 最小二乘方差分析 配合下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析，比較小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)在基因型之間的差異： y=+ Gi+e 其中： y 為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值； 為群體均值； 第 i 種基因型的固定效應(yīng)； e 為隨機(jī)殘差效應(yīng)。用 學(xué)習(xí)版 ）的 程完成。 2 （ E i 1/2） 2 Ei 第三章 結(jié)果與分析 24 第三章 結(jié)果與分析 因組提取結(jié)果 圖 3從血液中提取的基因組 脂糖凝膠電泳檢測。 圖 3羊血液提取的基因組 電泳結(jié)果 NA 3從耳組織中提取的基因組 在 脂糖凝膠電泳檢測。 M 圖 3羊耳組織提取的基因組 電泳結(jié)果 NA 以上的電泳檢測圖譜可以看出，基因組的大小大約在 50上 ,且提取的基因組 乎沒有托尾現(xiàn)象。經(jīng)檢測所提取的 度大約為 500l，結(jié)果表明提取的基因組 降解，可直接用于 增反應(yīng)。 因 增及多態(tài)檢測的結(jié)果與分析 3 外顯子 增及 態(tài)檢測結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù) 表的牛 因（登錄號(hào)： 列與綿羊該基因的 列 （登錄號(hào)： 7164398） 比對(duì)后 共設(shè)計(jì) 8 對(duì)引物，由上海 生工 生物有限公司合成。 之 后以所提取的綿羊基因組 模板進(jìn)行 異性擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖 3 圖 3 3 外顯子擴(kuò)增 (1088CR 3 088 第三章 結(jié)果與分析 25 對(duì) 3 外顯子序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，分別用 三種內(nèi)切酶對(duì)該片段進(jìn)行限制性酶切分析，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，沒有發(fā)現(xiàn)酶切多態(tài)位點(diǎn)。 4 外顯子 增及 態(tài)檢測結(jié)果 4 外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物為 2287增結(jié)果見圖 3在已擴(kuò)增 產(chǎn)物中間設(shè)計(jì)引物 ,將該片段分為 1100 1200個(gè)片段去擴(kuò)增 ,在這兩個(gè)擴(kuò)增片段中分別用內(nèi)切酶消化 ,上半部分用切，無多態(tài)產(chǎn)生，下半部分用 切， 有切開， 圖 34 外顯子擴(kuò)增 (2287 CR 4 287 5 外顯子 增及 態(tài)檢測結(jié)果 4 5 外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物為 233擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行不同綿羊品種的 析，沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)。 圖 3 5 外顯子擴(kuò)增 (233CR 5 33 第三章 結(jié)果與分析 26 圖 3因 4 5 外顯子的 析（ 12%聚丙烯酰胺凝膠） 2 % p e 5 an 7 外顯子 增及 態(tài)檢測結(jié)果 7 外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物為 805該擴(kuò)增產(chǎn)物上設(shè)計(jì)了 4 對(duì)引物，將其分別擴(kuò)增，產(chǎn)物長度分別為 265236222193擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行 析，結(jié)果顯示在第2 對(duì)，第 3 對(duì)引物上出現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，其余 2 對(duì)引物無多態(tài)位點(diǎn)。不同引物 增結(jié)果見圖 3同對(duì)引物 果見圖 3 A： 7 外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物（ 805 A： fo r 6 7 e (805 B： 7顯子擴(kuò)增產(chǎn)物（ 265 B： 7 -1 o f 265 第三章 結(jié)果與分析 27 C： 7顯子擴(kuò)增產(chǎn)物（ 236 C： 7 -2 e (2 36D： 7顯子擴(kuò)增產(chǎn)物（ 222 D： fo r 6 7 -3 o f 222E： 7顯子擴(kuò)增產(chǎn)物（ 193 E： 7 -4 e (1 93圖 3 7引物 增產(chǎn)物 fo r 4 7 第三章 結(jié)果與分析 28 A： 7段 果（ 265 A:an o f 7-1 265 B： 7段 果（ 236 B: an o f 7-2 t（ 236b p） C： 7段 果 (222C: an o f 7-3 t（ 222b p） 第三章 結(jié)果與分析 29 D： 7段 果 (193D: an o f 193 圖 3 7 4 對(duì)引物 果 fo r 4 -7 o f e 不同片段 態(tài)檢測結(jié)果分析 對(duì) 因 不同片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)分析，在 7 外顯子中設(shè)計(jì)的 4 對(duì)引物中有 2 對(duì)引物有多態(tài)位點(diǎn)的出現(xiàn)，對(duì)不同綿羊群進(jìn)行凝膠電泳分析，表明第 3 對(duì)引物不具有群體普遍性，只有第 2 對(duì)引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物在各個(gè)群體中均有不同基因型的存在。對(duì) 7 個(gè)個(gè)體進(jìn)行克隆測序， 用 析軟件對(duì)所測結(jié)果進(jìn)行分析，并上傳到 。 結(jié)果見圖 3示 。 因型的堿基序列與 序列一致，純合性 比雜合性 294 位（序列 6871756 中的 14 201 位）缺失了 個(gè)堿基，而純合性 相比 在 180（序列 6871756 中的 14 315 位） T 替換為 C。 ge n ot yp e AA ge n ot yp e C d e le t i T C） AA ge n ot yp e B B ge n ot yp e 圖 3同基因型測序結(jié)果 o f e 不同綿羊品種 基因外顯子 6 7 的基因頻率和基因型頻率的分析 對(duì)小尾寒羊、同羊、灘羊、歐拉羊進(jìn)行了 因外顯子 6 7 的基因型檢測， 第三章 結(jié)果與分析 30 同綿羊品種的基因型頻率和基因頻率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 3表 1 可見，在 4 個(gè)綿羊品種中，均檢測到 3 種基因型，且等位基因 B 略占優(yōu)勢，其頻率在 合性 2檢驗(yàn)結(jié)果表明 ， 4 個(gè)群體在該位點(diǎn)的基因頻率均處于 衡狀態(tài)。 表 34 個(gè)綿羊品種 位基因頻率 e an d o f o e 品種 數(shù)量基 因 頻 率 e 基 因 型 頻 率 2 c A B B 尾 寒 羊 93 2/93) 7/93) 4/93) 0 760 同羊 43 14/43) 14/43) 15/43) 0 953 灘羊 32 ) 1/32) 8/32) 0 283 歐 拉 羊 28 ) ) 5/28) 0 618 d f= 1， 2 0 。 05=2 0 。 01=2 c ( 0 . 0 5 ) 0 . 0 5 ,差異不顯著 . d i ff e r n o s i gn i fi c a n t l y 同綿羊品種 基因外顯子 67 基因型分布差異性檢驗(yàn) 不同綿羊品種 因外顯子 67 基因型分布差異檢驗(yàn)的結(jié)果得出 2=2 P 異顯著，對(duì)其進(jìn)行分割檢驗(yàn)，由表 3知，小尾寒羊和灘羊、歐拉羊 因型分布差異顯著 (P 0 . 5 為高度多態(tài)， 0 . 5 P 0 . 2 5 為中度多態(tài)， P 3 種基因型間差異不顯著（ P 在的調(diào)控元件及蛋白結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測 通過網(wǎng)站： (算機(jī)軟件分析預(yù)測轉(zhuǎn)化生長因子 1第 6 內(nèi)含子內(nèi)由于點(diǎn)突變造成的調(diào)控位點(diǎn)的改變 預(yù)測分值大于85 有效）顯示 ,由于多了 堿基 ,相比 B 型產(chǎn)生了 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白)。 201 （ 錄號(hào)： 分別對(duì)其進(jìn) 行增及 析。 泳結(jié)果見圖 3果見圖 3 A： 171 A： fo r 171 B： 283 B： 283 C： 289 C： 289 D： 306 D： fo r 306圖： 3 對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物 p o f 第三章 結(jié)果與分析 33 A： 結(jié)果 (171 A: an o f 171 B： 結(jié)果 (283 B: an o f 283 C： 結(jié)果 (289 C: an o f 289 第三章 結(jié)果與分析 34 D： 結(jié)果 (306 D: an o f 306 圖 3因 4 對(duì)引物 果 fo r 4 o f 2 外顯子 4 對(duì)引物 果分析 對(duì) 2 外顯子上 4 對(duì)引物進(jìn)行 析后，僅在第 2 對(duì)引物上發(fā)現(xiàn)有多態(tài)位點(diǎn)，其余 3 對(duì)引物均無多態(tài)位點(diǎn)出現(xiàn)。將第 2 對(duì)引物擴(kuò)增片段 種基因型各取 2 個(gè)個(gè)體的物進(jìn)行克隆測序。用 析軟件對(duì)所測結(jié)果進(jìn)行分析，并上傳到 。結(jié)果見圖 3示。 因型個(gè)體在箭頭所指處堿基為 C，而 因型個(gè)體在箭頭所指處為 T，可見 處 C應(yīng)于綿羊 第 558 位和 692 位。 綿羊 因 列的第 558 位和692 位堿基均為 T，因此將 定為野生型， 定為突變型， 該突變引起了氨基酸的改變，導(dǎo)致 231 位氨基酸異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸。 T C） T C） 圖 3同基因型測序結(jié)果 o f 第三章 結(jié)果與分析 35 不同綿羊品種 因 物的基因頻率和基因型頻率的分析 對(duì)小尾寒羊、同羊、灘羊、歐拉羊進(jìn)行了 因 物的基因型檢測，計(jì)算了不同綿羊品種的基因型頻率和基因頻率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 3由表中可見，在 4 個(gè)綿羊品種中，均檢測到 種基因型， 合型沒有出現(xiàn)，適合性 2 檢驗(yàn)結(jié)果表明 ， 4 個(gè)群體在該位點(diǎn)的基因頻率均處于 衡狀態(tài)。 表 34 個(gè)綿羊品種 因的基因型、等位基因頻率 e o f o e 品種 數(shù)量基 因 頻 率 e 因 型 頻 率 2c C D D 小 尾 寒 羊 3 0 903 2 0 096 8 0 806 5（ 75/93） 0 193 5（ 18/93） 0 037 5 同羊 43 0 872 0 0 128 0 744 2 （ 32/43） 0 255 8 （ 11/43） 0 065 6 灘羊 32 0 875 0 125 0 75 （ 24/32） 0 25 （ 8/32） 0 062 5 歐 拉 羊 28 0 928 6 0 071 4 0 857 1 （ 24/28） 0 142 9 （ 4/28） 0 020 4 d f= 1， 2 0 。 05= 3 . 8 4， 2 0 。 01= 6 . 6 3 , 2 c ( 0 . 0 5 ) 0 . 0 5 ,差異不顯著 . d i ff e r n os i gn i fi c a n t l y 同綿羊品種 因 物基因型分布差異性檢驗(yàn) 不同綿羊品種 因 物基因型分布差異檢驗(yàn)的結(jié)果得出 2=2 P異不顯著（ 因的雜合度、有效等位基因數(shù)合多態(tài)信息含量 表 34 個(gè)綿羊品種 純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量 h e o f in fo ur 遺 傳 參 數(shù) 小 尾 寒 羊 sh 同羊 灘羊 歐 拉 羊 ： P 0 . 5 為高度多態(tài)， 0 . 5 P 0 . 2 5 為中度多態(tài)， P B 3種基因型間差異不顯著。 對(duì)引物在 4個(gè)綿羊品種中均出現(xiàn) 多態(tài)位點(diǎn)在不同品種間基因型表現(xiàn)差異不顯著，屬于低度多態(tài)?？寺y序發(fā)現(xiàn) 4個(gè)綿羊品種中發(fā)生了新的 558位 T 92位 T 突變導(dǎo) 致 231位氨基酸異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸。 異顯著。 在 數(shù)進(jìn)行 關(guān)聯(lián) 分析 , R= R=R= 參考文獻(xiàn) 41 參考文獻(xiàn) 1. 杜立新等 記的研究，動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展 (陳宏權(quán)主編 )，中國農(nóng)業(yè)科技出版社， 2001， 96 99 2. 范青松 ,等 中國養(yǎng)羊 ,1992,(1):7 9. 3. 高惠娟綜述，周馥貞審校 卵巢功能調(diào)節(jié) 1996 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