學校編碼： 10384 分類號 密級 學 號： 20120051302048 碩 士 學 位 論 文 無致病力青枯雷爾氏菌誘導 植物 指導教師姓名： 副教授 講師 專 業(yè) 名 稱： 發(fā) 育 生 物 學 論文提交日期： 2008 年 06 月 論文答辯時間： 2008 年 08 月 學位授予日期： 2008 年 月 答辯委員會主席 ： 教授 評 閱 人： 教授 教授 2008 年 08 月 廈門大學學位論文原創(chuàng)性聲明 本人呈交的學位論文是本人在 導師指導下 ,獨立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，均在文中以適當方式明確標明，并符合法律規(guī)范和廈門大學研究生學術(shù)活動規(guī)范（試行）。 另外，該學位論文為（ ）課題（組）的研究成果，獲得（ ）課題（組）經(jīng)費或?qū)嶒炇业馁Y助，在（ ）實驗室完成。（請在以上括號內(nèi)填寫課題或課題組負責人或?qū)嶒炇颐Q，未有此項聲明內(nèi)容的，可以不作特別聲明。） 聲明人（簽名）： 年 月 日 目錄 廈門大學學位論文著作權(quán)使用聲明 本人同意廈門大學根據(jù)中華人民共和國學位條例暫行實施辦法等規(guī)定保留和使用此學位論文，并向主管部門或其指定機構(gòu)送交學位論文（包括紙質(zhì)版和電子版），允許學位論文進入廈門大學圖書館及其數(shù)據(jù)庫被查閱、借閱。本人同意廈門大學將學位論文加入全國博士、碩士學位論文共建單位數(shù)據(jù)庫進行檢索，將學位論文的標題 和摘要匯編出版，采用影印、縮印或者其它 方式合理復制學位論文。 本學位論文屬于： （ ） 文，于 年 月 日解密，解密后適用上述授權(quán)。 （ ） 用上述授權(quán)。 （請在以上相應括號內(nèi)打“”或填上相應內(nèi)容。保密學位論文應是已經(jīng)廈門大學保密委員會審定過的學位論文，未經(jīng)廈門大學保密委員會審定的學位論文均為公開學位論文。此聲明欄不填寫的，默認為公開學位論文，均適用上述授權(quán)。） 聲明人（簽名）： 年 月 日 目錄 目錄 中文 摘要 . I 英文摘要 . 前言 . 1 枯雷爾氏菌的致病性研究 . 1 枯雷爾氏菌的分類地位 . 1 枯雷爾氏菌的寄主范圍 . 1 枯雷爾氏菌的致害特性 . 1 枯雷爾氏菌的種下分類 . 2 枯雷爾氏菌的侵染及傳播途徑 . 5 枯雷爾氏菌所引起的植物青枯病的防治措施及成效 . 5 要防治措施 . 6 物防治 . 7 性植株的構(gòu)建 . 11 物防治的展望 . 12 枯雷爾氏菌的致病機理研究進展 . 12 . 13 . 14 . 14 G 和 . 14 動性 . 15 枯雷爾氏菌所引起的植物青枯病的生物防治機理研究進展 . 15 菌素的產(chǎn)生 . 15 導抗病性 . 15 殖位點競爭 . 18 它生防機制 . 18 研究的實驗基礎(chǔ)及 前期工作 . 19 目錄 研究的目的意義及主要內(nèi)容 . 19 2 材料與方法 . 20 驗材料 . 20 驗菌株及來源 . 20 驗植物 . 20 劑及配方 . 20 要儀器 . 20 驗方法 . 20 枯菌的培養(yǎng) . 20 2 52 體外抑制作用 . 21 茄組培苗的培養(yǎng)及接菌方法 . 21 2種后提高番茄的 抗病效果測定 . 22 關(guān)的生理生化指標測定 . 22 溶性蛋白含量測定 . 25 蛋白電泳 . 26 據(jù)處理 . 27 3 結(jié)果與分析 . 28 2 52 體外抑制作用 . 28 2番茄的致病性測定 . 28 2種后提高番茄的抗病效果測定 . 29 關(guān)的生理生化指標測定 . 30 . 30 . 32 . 34 . 36 . 38 類 . 40 葉綠素 . 42 目錄 . 44 溶性蛋白 . 46 蛋白 . 48 4 討論 . 50 5 參考文獻 . 53 致謝 . . I . . 1 he of . 1 . 1 . 1 . 1 . 2 of . 5 of . 5 . 6 . 7 of . 11 . 12 of . 12 . 13 . 14 . 14 G G . 14 . 15 of of . 15 of . 15 . 15 . 18 . 18 of . 19 of . 19 2 . 20 . 20 . 20 . 20 . 20 . 20 . 20 . 20 n 22 . 21 of . 21 of to . 22 of . 22 of . 25 of . 26 . 27 3 . 28 n 22 . 28 of 2. 28 of of . 29 of . 30 . 30 . 32 . 34 . 36 . 38 . 40 . 42 2. 44 . 46 . 48 4 . 50 5 . 52 .I 摘要 本研究選取了一株無致病力青枯雷爾氏菌 分析了其對寄主植物番茄的致病性及提高抗病力效果、對強致病力青枯雷 爾氏菌 直接抑制作用及其侵染后導致寄主植物番茄的部分生理生化指標的變化。 主要研究結(jié)果如下： 1通過接種鑒定，發(fā)現(xiàn)無致病力青枯雷爾氏菌 種番茄后不發(fā)病。 2 用 無致病力青枯雷爾氏菌 種番茄 24 h 再接種強 致病力青枯雷爾氏菌 現(xiàn)無致病力 青枯雷爾氏菌 種后能提高番茄對青枯病的抗性，明顯推遲番茄青枯病的發(fā)生，降低病情指數(shù)，具有很好的 提高抗病力的 效果。 3采用平板對峙法及抑菌圈法分析 外抑制作用發(fā)現(xiàn)：能對 生長產(chǎn)生直接抑制作用。 4測定了無致病力 青枯雷爾氏菌 種后， 番茄植株中與 關(guān)的 類、葉綠素、 些 生理生化指標的變化， 根據(jù)對試驗所測定的 8 個 關(guān) 生理生化 指標 的分析 ， 推測 無致病力青枯雷爾氏菌 誘導寄主產(chǎn)生抗病性，而且誘導抗病性與其引起的寄主植物活性氧爆發(fā) 及活性氧代謝 密切相關(guān)。 5蛋白含量測定及總蛋白 泳分析發(fā)現(xiàn)， 無致病力 青枯雷爾氏菌 種后能導致寄主植物可溶性蛋白 含量及種類的變化。蛋白的變化可能也與 關(guān) 。 關(guān)鍵詞： 無致病力青枯雷爾氏菌； I n an to a In of as 1. t on 2. 24 h to of to on 3. no on 4. 2 AR of of 5. be 言 1 1 前言 枯雷爾氏菌的致病性研究 枯雷爾氏 菌的分類地位 青枯雷爾氏菌引起植物細菌性青枯病 ,是一種毀滅性的土傳病。 細菌性青枯病從發(fā)現(xiàn)至今已有 140 多 年的歷史 ， 美國 其病原物定名為青枯假單胞桿菌 ( 研究表明 ， 假單胞桿菌(為 5 個 源群，青枯假單胞桿菌包括在 源群 1。根據(jù) 子雜交，以同源性分析為基礎(chǔ)，建議將其列入 2。通過對 16 S 因序列測定 和聚類分析 等 大量工作，細菌性青枯病 原菌 被列入 雷爾氏 屬 ( 與 同一屬 ，名為 青枯雷爾氏菌 (3,4。細 菌性青枯病原菌的中文名稱也經(jīng)歷了變化，起初稱為青枯假單胞桿菌，隨著其分類地位的變化，而后稱為青枯雷爾氏菌 5，本研究中采用的中文名為青枯雷爾氏菌 (簡稱青枯菌 )。 枯雷爾氏菌的 寄主范圍 青枯 雷爾氏 菌引起的 植物 細菌性青枯病 ， 主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū) 。 青枯 雷爾氏 菌可危害 44 個科的 300 多種 植物 6， 表現(xiàn)出高度的寄主多態(tài)性，被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有種子植物和被子植物，有雙子葉植物和單子葉植物等。 危害較重、分布較廣的主要寄主有馬鈴薯、番茄、煙草、茄子、 辣椒、花生、姜、香蕉、 甘薯 、麻等 7。近年又陸續(xù)有報道在油橄欖、桑、木麻黃、木薯、番荔枝、澳洲松、桉樹等木本植物，以及蠶豆、大豆、豇豆、羽扇豆、南瓜、大白菜、蘿卜、茴香、棉花、三葉草、聚合草、草莓等草本植物上也發(fā)生 細菌性青枯病 ，可以說 細菌性青枯病 是危害最大、分布最廣、造成損失最重的植物病害之一 8。 枯雷爾氏菌的致 害特性 鄭繼法 等 9研究指出，青枯雷爾氏菌侵害寄主 (特別是茄科 植物 )后，寄主植前言 2 物 (如番茄、辣椒、茄子等 )在發(fā)病時出現(xiàn)青枯癥狀，即植物的葉子萎蔫下垂，但葉子仍呈綠色。發(fā)病初期，部 分葉子 在陽光下 發(fā)生萎蔫 ，在早晚恢復正常 ；發(fā)病中期，大部分葉子在陽光下發(fā)生萎蔫，在早晚恢復正常；發(fā)病后期，萎蔫的葉子無法恢復 ，逐漸枯黃 。青枯萎蔫 是 青枯雷爾氏菌危害寄主植物的重要 致害 特征。橫切病株莖部可見到維管束變褐，用手擠壓，有白色菌膿從切口處溢出，此法可作為田間快速診斷 細菌性青枯病 的方法之一。 結(jié)合各地生姜、番茄、辣椒、茄子、煙草、花生作物的生長期，在各作物進入生殖生長初期，氣溫在 28 以上，晴雨交替的日子， 細菌性青枯病 較為多發(fā)。細菌性青枯病 對茄科植物的危害尤為嚴重。我國南方各省茄科作物上都有 細菌性青枯病 發(fā) 生危害，對南京地區(qū)茄科作物 細菌性青枯病 調(diào)查結(jié)果表明，一般田塊發(fā)病率為 25%30%，嚴重田塊可達 80%100%10。馬鈴薯對 細菌性青枯病 十分敏感，通常導致產(chǎn)量損失 20%30%，嚴重時損失可達 75%以上 11。 我國南方廣東、廣西、海南等地相當數(shù)量的農(nóng)田番茄因受到了致病菌的侵染，導致經(jīng)濟上的主要損失 12。 番茄生長過程經(jīng)常受到 細菌性青枯病 的危害，特別在番茄結(jié)果期，適逢高溫高濕的雨季，可引起毀滅性的危害 13。福建煙草的 細菌性青枯病 發(fā)病率一般為 10%30，嚴重田塊 為 100，以至全田煙草枯死 絕收 ， 此病已成為福建煙草生產(chǎn)的主要障礙之一 14。此外，在花生、生姜、甘薯等作物上， 細菌性青枯病 發(fā)生亦很嚴重，易感病作物面積近 04 5。隨著研究的進展， 細菌性青枯病 原菌新寄主不斷發(fā)現(xiàn) 16。 由于 全球氣溫變暖等因素 的影響 ，在世界范圍內(nèi)， 細菌性青枯病 發(fā)生危害越來越嚴重 17。近年來，我國南方桉樹、木麻黃、桑樹等林木 細菌性青枯病 害 的 爆發(fā)， 給 林業(yè)生產(chǎn) 造成了 巨大經(jīng)濟損失 18。 枯雷爾氏菌的種下分類 理小種 青枯雷爾氏菌的種下分 類 復雜， 前人主要從生理小種 (19、生化型(20、血清型 (21、溶源型 (22、 致病型 (23、基因型 (24等方面對種下分 類 進行研究 。 生理小種 (據(jù)青枯雷爾氏菌對不同寄主致病性的表現(xiàn)進行劃分。5等提出了青枯雷爾氏菌小種鑒定方法，將生理小種分為 3 個類型，選用茄子與香蕉作為鑒別寄主，采用排除法，即若不侵染香蕉則非生理小種 2，前言 3 若可侵染茄子則非生理小種 3。 國際上對青枯雷爾氏菌種下分類研 究較多 ，盧同26綜述了國際上對青枯雷爾氏菌 生理小種分類標準 ： 能侵染煙草及多種茄科植物，浸潤于煙葉上能產(chǎn)生壞死枯斑反應，在含 ；能侵染香蕉和海力康 (浸潤煙葉產(chǎn)生過敏反應，在 ；侵染馬鈴薯和番茄，對煙草弱侵染，在煙葉上形成黃化斑，在 ；能侵染馬鈴薯和茄子、浸潤煙葉產(chǎn)生過敏性反應，酪氨酸酶活性中等的定為生理小種 4。 我國植病學者對木麻黃、甘薯 、馬鈴薯、花生、聚合草、油橄欖、姜、桑等作物青枯雷爾氏菌的生理小種進行研究，結(jié)果表明：桑青枯雷爾氏菌屬于生理小種 1 和 4，馬鈴薯青枯雷爾氏菌屬于生理小種 1 和 3，而木麻黃、花生、聚合草、油橄欖、姜、番茄、甘薯等作物的青枯雷爾氏菌均屬于生理小種 118,19,2629。 化型 生化型 (據(jù)青枯雷爾氏菌對生化物質(zhì)的利用進行劃分。自 60 年代以來，國際上對不同寄主的青枯雷爾氏菌株的生化型進行了研究，澳大利亞的據(jù)青枯雷爾氏菌株對 3 種雙糖 (乳糖、麥芽糖、纖維二糖 )和 3 種六碳醇 (甘露醇、甜醇、山梨醇 )的利用情況，把青枯雷爾氏菌區(qū)分為 4 個生化型 30。張廣民等 31對山東省姜瘟病株進行了生化型研究，表明山東省姜瘟病菌存在 個生化型。曾憲銘 等 20分析了 13 種作物上的青枯雷爾氏菌的生化型，發(fā)現(xiàn)來自茄子的青枯雷爾氏菌屬于生化型 同地點采集的青枯雷爾氏菌的生化型存在著差異。林美琛 等 32分析了浙江省番茄青枯雷爾氏菌的生化型，表明屬于生化型 占 生化 型 I 的占 生 化型 占 還有 新型 ，無法劃入現(xiàn) 有的生化型分類標準。同一菌株在無菌水中保存一段時間后，其生化型會發(fā)生變異，這表明青枯雷爾氏菌的生化型并不是一個穩(wěn)定的分類特征，因此生化型的劃分在分類學是否有意義值得進一步探討。 清型 血清型 (根據(jù)青枯雷爾氏菌對血清的交互凝集反應進行劃分。從80 年代開始，我國研究青枯雷爾氏菌的學者，采用交互凝集反應法和瓊脂雙向前言 4 擴散法，對桑和木麻黃的血清型進行了研究，結(jié)果表明：桑和木麻黃青枯雷爾氏菌分屬于血清型 I、 以代表不同生化型的 4 個青枯雷爾氏菌的膜蛋白為免疫原制備了 4 個相應的抗血清，對我國植物青枯雷爾氏菌的血清分型進行了研究，瓊脂雙擴散試驗結(jié)果表明：來自我國 6 個省的 19 種寄主植物的 212 個青枯雷爾氏菌株可分為 8 個血清型，其中血清型 I 為優(yōu) 勢類群，包括茄科主要植物等 13 種寄主的 147 個菌株，占全部供試菌株 69 33,34。 90 年代福建省農(nóng)科院采用酶聯(lián)免疫吸附法 (應用單克隆抗體技術(shù)，用甘薯青枯雷爾氏菌免疫的 小鼠脾細胞與鼠骨髓瘤細胞雜交融合，建立了 4 株分泌抗甘薯青枯雷爾氏菌的特異性、有鑒別力的雜交瘤細胞株： 中雜交瘤細胞株染色體數(shù)范圍為 98104。用 測定 156 株甘薯青枯雷爾氏菌的血清型，結(jié)果表明：甘薯青枯雷爾氏菌可分為 7 型 (I21。 源型 溶源型 (利用青枯雷爾氏菌對植物病原菌噬菌體的?；苑磻M行劃分。采用單層平板法，用分離自桑青枯雷爾氏菌的噬菌體 9 個桑青枯雷爾氏菌株，結(jié)果表明：桑青枯雷爾氏菌噬菌體 生、木麻黃、馬鈴薯、辣椒、煙草、姜和甘薯的青枯雷爾氏菌株，用 兩個噬菌體可將 19 個桑青枯雷爾氏菌株區(qū)分為6 個溶源型 22。 由于溶源型分化檢測方法的測定過程復雜，噬菌體的分離保存難度大，目前很少應用于青枯雷爾氏菌種下分類的研究。 病型 致病型 (根據(jù)青枯雷爾氏菌 對寄主的致病性差異進行劃分。植病工作者根據(jù)青枯雷爾氏菌對寄主的致病性差異劃分為不同致病型：分為強、弱或強、中、弱或更多的致病類型。 盧同等 26對作物青枯雷爾氏菌致病型的研究進行了綜述，認為對作物青枯