p 的 分類號(hào)： 單位代碼： 10389 密 級(jí)： 學(xué) 號(hào)： 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 茄科 尖孢鐮刀菌綠色熒光蛋白 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的優(yōu)化 及其定殖特性的研究 學(xué) 科 門 類：理學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱：微生物學(xué) 二級(jí)學(xué)科名稱：微生物學(xué) 研 究 方 向：應(yīng)用微生物學(xué)與基因工程 研 究 生 ： 指 導(dǎo) 教 師： 研究 員 、 博士 完 成 時(shí) 間：二 0 一一年四月 s of in 2011 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件， 允許論文被查閱和借閱，學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： 目 錄 中文摘要 . 1 . 2 第一章 前言 . 3 1. 茄科枯萎病的發(fā)生與危害 . 3 科枯萎病的分布 . 3 生原因 . 3 播危害 . 3 病規(guī)律 . 4 2. 茄科枯萎病的病原菌 . 5 3. 茄科枯萎病的防治 . 5 4. 其在絲狀真菌中的研究概況 . 7 礎(chǔ)理論研究概況 . 7 為標(biāo)記物所具有的優(yōu)點(diǎn) . 7 絲狀真菌研究中的應(yīng)用 . 7 5. 本研究的目的及意義 . 8 第二章 茄科作物枯萎病原菌的分離與鑒定 . 10 引言 . 10 1 材料與方法 . 10 料 . 10 法 . 10 2 結(jié)果與分析 . 11 科作物枯萎病害調(diào)查及其發(fā)病癥狀 . 11 科枯萎病菌的分離與鑒定 . 12 原菌的分子鑒定 . 14 病性測(cè)定結(jié)果 . 16 3 討論 . 16 第三章 番茄尖孢鐮刀菌 . 17 引言 . 17 1 材料與方法 . 17 料 . 17 法 . 18 2 結(jié)果與分析 . 19 孢鐮刀菌的原生質(zhì)體制備 . 19 2.2 因的轉(zhuǎn)化 . 19 化子的穩(wěn)定性篩選 . 20 3 討論 . 21 第四章 番茄尖孢鐮刀菌 的生物學(xué)特性 . 22 引言 . 22 1 材料與方法 . 22 料 . 22 法 . 22 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 2 結(jié)果與分析 . 23 化子的菌體形態(tài)及生長(zhǎng)速度 . 23 同 轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的影響 . 24 化子對(duì)潮霉素的抗性水平分析 . 25 3 討論 . 25 第五章 番茄尖孢鐮刀菌在植株體內(nèi)的侵染定殖 . 26 引言 . 26 1 材料與方法 . 26 料 . 26 法 . 26 2 結(jié)果與分析 . 26 株及組織發(fā)病癥狀觀察 . 26 聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)標(biāo)記菌 . 27 3 討論 . 30 第六章 番茄尖孢鐮刀菌在土壤中的定殖特性 . 32 引言 . 32 1 材料與方法 . 32 料 . 32 法 . 32 2 結(jié)果與分析 . 32 同土壤中轉(zhuǎn) 因鐮刀菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化 . 32 同土壤中轉(zhuǎn) 因鐮刀菌的熒光觀察 . 33 3 討論 . 35 第七章 番茄尖孢鐮刀菌對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 . 36 引言 . 36 1 材料與方法 . 36 料 . 36 法 . 36 2 結(jié)果與分析 . 37 分析轉(zhuǎn) 因鐮刀菌對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 . 37 3 討論 . 40 第八章 結(jié)論與展望 . 41 1 結(jié)論 . 41 2 展望 . 41 參考文獻(xiàn) . 42 個(gè)人簡(jiǎn)歷 . 46 致 謝 . 47 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 中文摘要 近年來，茄科病害不斷持續(xù)發(fā)生，由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病，對(duì)茄科作物危害最大，防治困難。本文從福建省各地區(qū)采集了枯萎病植株及根際土樣本，分離了其中的致病真菌，經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌。對(duì)番茄枯萎病菌 進(jìn)行 因轉(zhuǎn)化，得到了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。在此基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)化子在植株及根際土內(nèi)的定殖特性進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下： 從福建福州等四個(gè)地區(qū)采集樣本，分離并鑒定了 147 株致病菌，經(jīng)鑒定 106 株為鐮刀菌屬真菌，其中尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)菌群。 采取 導(dǎo)的方法構(gòu)建了茄科尖孢鐮刀菌的 化體系，尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體制備是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，影響其制備的因素主要包括酶系的選擇、滲透壓穩(wěn)定劑的選擇、菌絲菌齡等。結(jié)果顯示最佳反應(yīng)條件為：滲透壓穩(wěn)定劑選擇 0.8 系為 20 mg/壁酶 與 崩潰酶的混合酶系； 菌齡為 12h 的新鮮菌絲； 28 ， 70 r件下酶解 消化 2-3 h。 對(duì)所得轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生長(zhǎng)速度等生物學(xué)特性的研究，標(biāo)記后的菌株在菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度及 多數(shù)轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳，熒光穩(wěn)定，有利于下一步研究。 運(yùn)用共聚焦激光掃描顯微鏡跟蹤觀察標(biāo)記菌株在番茄植株內(nèi)的侵染過程，表明根部是致病菌株侵染主要位點(diǎn)，標(biāo)記菌株能夠在根莖部很好的定殖，致病力較強(qiáng)。 研究了 因標(biāo)記菌株在不同土壤中的定殖特性，結(jié)果表明，標(biāo) 記菌株能夠在不同性質(zhì)的土壤內(nèi)定殖，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其定殖密度逐漸下降。 析表明，引入的標(biāo)記菌株對(duì)不同土壤脂肪酸生物標(biāo)記影響不相同，但種類上基本呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，各土壤的細(xì)菌特征性脂肪酸都占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。 關(guān)鍵詞： 茄科枯萎?。患怄哏牭毒?；綠色熒光蛋白；生物學(xué)特性；定殖 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 n of At of f sp of in as 147 06 of FP so .8 -1 20 mg/mL 2h of 8 ,0 r -3 h. of of pH on of to of of by in of of in in as on to by of 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 3 第一章 前言 1. 茄科枯萎病的發(fā)生與危害 科枯萎病的分布 全世界茄科植物大約 80 屬 3000 種，分布范圍廣泛，遍及溫帶及熱帶地區(qū)；我國(guó)共有 24 屬 105種 35 變種 1。包括枸杞屬、天仙子屬、曼陀羅屬、煙草屬、番茄屬、辣椒屬等。茄科蔬菜包括茄子、辣椒、番茄、馬鈴薯等，在蔬菜中占有重要地位，是百姓生活中必不可少的蔬菜美食，因此培育優(yōu)良的茄科蔬菜品種對(duì)于滿足社會(huì)生產(chǎn)、生活等方面的需要，具有重大的理論 和實(shí)踐意義 2。 由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病，對(duì)茄科作物危害最大，防治困難，作物受害面積大，給農(nóng)民生產(chǎn)增收帶來很大困難，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，成為影響茄科蔬菜生產(chǎn)的一個(gè)重要病害 3。 尖孢鐮刀菌(一種世界性分布的病原真菌，存在于各種土壤中，甚至在極端環(huán)境也可分離到4。例如，辣椒枯萎病在國(guó)外早有報(bào)道， 20世紀(jì) 50年代在我國(guó)由俞大紱首次報(bào)道，目前已廣泛分布于陜西、甘肅、廣西、四川、湖南、北京、浙江、山西等省 5。而番茄枯萎病在我國(guó)南方地區(qū)分布較多，影響較大，例如在廣西、 廣東、福建等省，但是在北方寒冷地區(qū)如黑龍江省也逐漸流行開來 6。尖孢鐮刀菌的寄主范圍也十分廣泛，目前已報(bào)道的被尖鐮孢菌嚴(yán)重為害的作物有香蕉、番茄、辣椒、棉花、蘿卜、西瓜、黃瓜、草莓、鷹嘴豆、甘蔗、 郁金香 等多種植物。 生原因 近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，同時(shí)為了適應(yīng)人們對(duì)膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整及優(yōu)化，我國(guó)茄科作物的種植面積不斷擴(kuò)大，在給廣大農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，茄科作物病蟲害也越來越嚴(yán)重。 當(dāng)前，國(guó)內(nèi)茄科作物的主要種植品種包括了辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯等，為農(nóng)業(yè)主栽品種。這幾種作物常見病害有： 灰霉病、黃萎病、枯萎病及青枯病等，主要病原菌有真菌、細(xì)菌，還有病毒導(dǎo)致的病害。但這些病害中，尤以枯萎病致病菌導(dǎo)致的病害最為廣泛、損失最為嚴(yán)重。一些種植戶由于管理不善或其他原因?qū)е铝丝菸〉陌l(fā)生與快速蔓延，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。分析有以下幾個(gè)主要原因： 連作致病，我國(guó)農(nóng)村大部分地區(qū)的茄科種植戶相對(duì)穩(wěn)定，連作通常在 3萎病菌在病殘?bào)w和土壤中腐生，連年繁殖積累導(dǎo)致病原不斷增加。而發(fā)病率也不斷攀升，有的田塊達(dá)到 80以上。 種子帶菌， 枯萎病原菌以菌絲體或厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤中或附著在種子上越冬。帶 菌的種子和帶有病殘?bào)w的有機(jī)肥是無病區(qū)的初始感染源，病原菌從幼苗移栽傷口侵入到維管束內(nèi)并繁殖蔓延，引起作物萎蔫。 蟲害導(dǎo)致，部分田塊的土壤中存在有一定量的線蟲等地下害蟲，病原菌從害蟲危害后的傷口侵入根部從而導(dǎo)致感染。 肥水管理不當(dāng)，施肥水平較高的大棚其枯萎病發(fā)病率明顯高于施肥水平較低的大棚，原因是植株根系處于高肥水土壤環(huán)境中，生長(zhǎng)緩慢，加之低地溫形成根腐傷口，病原菌隨水傳播。同時(shí)肥料結(jié)構(gòu)對(duì)該病的影響也較大，氮、磷肥施用過多，而鉀肥和有機(jī)肥的施用不足，造成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過旺，植株機(jī)體的抗病性降低，雨天后放晴及氣溫升高 ，多方面因素導(dǎo)致了感病機(jī)率增加 7。 播危害 隨著生產(chǎn)集約化程度的提高，茄科作物保護(hù)地的種植面積逐年擴(kuò)大且存在重茬，導(dǎo)致茄科病害日趨嚴(yán)重，其中枯萎病最為普遍，嚴(yán)重影響了蔬菜品質(zhì)及產(chǎn)量，直接影響了農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)收入。 自本世紀(jì)初（ 1905）發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病以來，在世界上大部分國(guó)家均有發(fā)生 8。如今的番茄枯萎病福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 已成為其主要病害之一，發(fā)病規(guī)模越來越大，有的地方發(fā)病率達(dá)到 80，病株率在 10 減產(chǎn)10 給番茄生產(chǎn)帶來巨大威脅 9。辣椒枯萎病是由半知菌亞門尖孢鐮刀菌辣椒專化型（ f 染引起的。在發(fā)病地區(qū)，該病的發(fā)病率一般為 15 嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70 有時(shí)甚至導(dǎo)致絕收，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病在國(guó)外早有報(bào)道 10， 20世紀(jì) 50年代在我國(guó)由俞大紱最早鑒定 11。以后，北京李明遠(yuǎn)等（ 1987） 12、浙江葛起新（ 1991） 13等也有記述。目前陜西、甘肅、廣西、四川、湖南、北京、浙江、山西等地已相繼有此病的報(bào)道。保護(hù)地茄子的土傳病害較為嚴(yán)重，有些病害的病菌在土壤中存活時(shí)間可長(zhǎng)達(dá) 3用化學(xué)藥劑很難控制，如枯 萎病、黃萎病等非常頑固，難以防治。一旦條件適宜，可能會(huì)造成大流行。而老菜區(qū)，發(fā)病率逐年提高，嚴(yán)重地塊發(fā)病率在 50 甚至絕收，給生產(chǎn)帶來巨大損失 14。 枯萎病是種土傳病害，主要危害植株維管束，一般在作物花期或結(jié)果期開始發(fā)病，癥狀自下而上逐漸顯現(xiàn)，該病傳染性強(qiáng)，但病程較為緩慢，一般 15同種蔬菜作物的具體表現(xiàn)癥狀有差異 ：番茄枯萎病在開花結(jié)果期始發(fā)，發(fā) 病初期僅莖的一側(cè)自下而上出現(xiàn)凹陷區(qū)，致一側(cè)葉發(fā)黃，變褐后萎焉枯死；也有的從植株距地面近地葉序始發(fā)，逐漸向上蔓延。剖開病莖，維管束變褐 ，濕度大時(shí)，病部產(chǎn)生粉紅色霉層，即病菌的分生孢子梗和分生孢子，無乳白色粘液流出，有別于青枯病 15,16；茄子枯萎病，病株葉片自上而下逐漸變黃枯萎，癥狀多表現(xiàn)在一、二層分支上，有的同一葉片僅半邊黃，另一半健康如常，該病易于黃萎病混淆，需要 17；甜椒、辣椒枯萎病，發(fā)病初期根部或根頸處常發(fā)生水漬狀褐色斑點(diǎn)，嫩芽和嫩葉生長(zhǎng)緩慢，色澤暗，發(fā)病輕的在晴天中午萎蔫，早晚和陰天恢復(fù)正常，可持續(xù) 2期根頸處及主根、側(cè)根基部皮層干裂，容易剝落，植株下部葉片大量脫落，莖基部皮層發(fā)生水漬狀腐爛，莖稈和 葉片迅速凋萎。發(fā)病后期，病株側(cè)根很少，植株很容易被拔起。相對(duì)濕度較大時(shí)，病部長(zhǎng)出豐茂的白色菌絲或藍(lán)綠色霉?fàn)钗?。莖基部近地面段干腐或出現(xiàn)縱向枯死的長(zhǎng)條斑。折斷莖稈可見根頸部維管束變褐，外部也常呈褐色。病株地下部根系也呈水浸狀軟腐，皮層極易剝落，木質(zhì)部變成暗褐色至煤煙色 18 病規(guī)律 番茄枯萎病以菌絲體，厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤、糞肥或附著在種子上越冬番茄種子帶菌，成為下一年的初次侵染源，病菌主要從根部、根莖部的傷口侵入，然后在維管束中大量繁殖，阻塞導(dǎo)管并產(chǎn)生毒素。毒素在植株體內(nèi)上下擴(kuò)散。植株在導(dǎo)管被 阻和毒素的雙重作用下使整株枯死。帶病種子的調(diào)運(yùn)是本病遠(yuǎn)距離傳播的途徑。田間病菌的傳播主要靠流水和帶菌土壤。土壤潮濕，連作，耕作時(shí)傷根，生長(zhǎng)勢(shì)弱，氮肥施用過量或缺少鉀肥的地塊均易發(fā)病。而枯萎病株的空間分布格局亦是該病原菌種群的重要屬性之一，由物種的遺傳特性和生態(tài)環(huán)境條件決定。 番茄枯萎病喜高溫高濕。發(fā)病程度與土溫關(guān)系很大。發(fā)病最適土溫為 26 ，最高為 33 ，21 以下病害受抑制。暴雨過后，天氣晴朗，氣溫回升有利于病害的擴(kuò)展蔓廷，特別在酸性較大的土壤，病害擴(kuò)展更快。就番茄生育期看，發(fā)病高峰期出現(xiàn) 于植株生長(zhǎng)中后期；從季節(jié)看，夏植番茄和 911冬末初春播種移栽， 319。辣椒枯萎病由鐮刀菌引起，只危害辣椒和甜椒。病原菌主要以厚垣孢子在土壤中越冬，在土壤中可進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的腐生生活，據(jù)報(bào)道，該病菌在土壤中存活年代為 6菌主要借助灌溉水或雨水傳播，也可隨病土借風(fēng)吹到別處。辣椒枯萎病的發(fā)生的最適溫度為 24 ，高于 35 或低于 17 均不利于其發(fā)育。排水不良、畦面凹凸不平、干濕不均的地塊發(fā)