1 學(xué)校編碼： 10384 分類號 密級 學(xué)號： 廈 門 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 of 導(dǎo)教師姓名： 研究員、教授 專 業(yè) 名 稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué) 論文提交日期：二零零七年九月 論文答辯時間： 學(xué)位授予日期： 答辯委員會主席 ： 評 閱 人： 2007 年 9 月 2 廈門大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 茲呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考的 其他個人或集體的研究成果，均在文中以明確方式標(biāo)明。本人依法享有和承擔(dān)由此論文而產(chǎn)生的權(quán)利和責(zé)任。 聲明人（簽名）： 年 月 日 3 目錄 中文 摘 要 . 1 英文摘要 . 2 第一章 前言 . 4 類與生命科學(xué)研究進(jìn)展 . 4 糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析概述 . 5 糖的分離純化 . 5 糖的結(jié)構(gòu)分析 . 6 糖的結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系 . 8 級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系 . 8 子量與活性的關(guān)系 . 9 級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系 . 10 糖的結(jié)構(gòu)修飾 . 11 青霉屬真菌多糖的研究現(xiàn)狀 . 13 擬青霉多糖（ . 13 尼擬青霉多糖 . 13 腳擬青酶多糖（ . 13 紫擬青霉多糖 . 14 紫擬青霉 . 14 題依據(jù)和本研究的主要研究內(nèi)容 . 16 題依據(jù) . 16 要研究內(nèi)容 . 16 第二章 淡紫擬青霉菌株的分類鑒定及其培養(yǎng)特性 . 17 言 . 17 料與方法 . 17 4 試菌株來源 . 17 試菌株的鑒定 . 17 試菌株培養(yǎng)特性研究 . 19 果與分析 . 19 紫擬青霉 株的 鑒定 . 19 紫擬青霉 株的培養(yǎng)特性 . 22 論 . 29 紫擬青霉的鑒定 . 29 紫擬青霉的培養(yǎng)特性 . 29 第三章 淡紫擬青霉多糖的提取與 分離 純化 . 31 言 . 31 料與方法 . 32 紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的提取 . 32 紫擬青霉胞內(nèi)外 多糖粗提物的性質(zhì)鑒定 . 32 紫擬青霉胞內(nèi)外 粗 多糖的分離與純化 . 33 果與分析 . 34 紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的提取 . 34 紫擬青霉胞內(nèi)外多糖粗提物的性質(zhì)鑒定 . 35 紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的分離與純化 . 35 論 . 39 紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的提取與性質(zhì)鑒定 . 39 紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的分離 . 39 紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的純化 . 40 第四章 淡紫擬青霉多糖的結(jié)構(gòu)分析 . 41 言 . 41 料與方法 . 42 品分子量的測定 . 42 品單糖組成分析 . 42 5 碘酸氧化及甲酸測定 . 42 解 . 42 外光譜分析 . 43 果紅結(jié)合實驗 . 43 果與分析 . 43 品分子量的測定 . 43 品單糖組成分析 . 44 碘酸氧化及甲酸測定 . 44 解 . 45 外光譜分析 . 45 果紅結(jié)合實驗分析 . 46 論 . 47 第五章 淡紫擬青霉多糖對鐮刀菌的抑菌活性 . 48 言 . 48 料與方法 . 48 試菌株來源 . 48 紫擬青霉粗多糖對尖孢鐮刀菌菌絲生長的影響 . 48 紫擬青霉粗多糖對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響 . 49 紫擬青霉多糖 品對尖孢鐮刀菌的抑制作用 . 49 果與分析 . 49 紫擬青霉粗多糖對尖孢鐮刀菌生長的影響 . 49 紫擬青霉粗多糖對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響 . 49 紫擬青霉多糖 品對尖孢鐮刀菌的抑制作用 . 51 論 . 51 第六章 結(jié)論和展望 . 53 論 . 53 望 . 54 6 參考文獻(xiàn) . 55 論文研究期間發(fā)表的文章 . 62 致謝 . 63 7 .of .of 5 of . of .of . . .of .of . . . . .7 . .of of . of .8 he of . of . of . of . of . of .of . 31 . of of . of . of of . of . of . of . of .of . 41 .9 . . . . . . . . . . . .of to . of . of to . of to . 49 . of to . of to .10 51 . .of . 63 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 1 摘要 篩選到一株對枯萎病病原菌 性物質(zhì)初步篩選結(jié)果表明其胞外粗多糖具有抑菌活性。 本論文對該菌株的胞內(nèi)、外多糖進(jìn)行了提取、純化研究，并對純化所得的兩個單組分多糖 行了結(jié)構(gòu)分析以及抑菌活性測定。 1、 通過形態(tài)學(xué)和 列分析，鑒定出分離保存的菌株為淡紫擬青霉。對其培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究。 2、 淡紫擬青霉發(fā)酵液的胞內(nèi)、胞外物質(zhì)經(jīng)過醇析法加乙醇 3 倍即可得到多糖粗提物。經(jīng)過測試反應(yīng)驗證，該粗提物為多糖，并具有凝膠多糖的理化特性。進(jìn) 一步的分離實驗中，發(fā)現(xiàn)經(jīng) 脫蛋白 35 次后，可以使淡紫擬青霉粗多糖中的蛋白質(zhì)含量低于 脫蛋白后的胞內(nèi)、外粗多糖經(jīng)凝膠柱層析純化后各自得到一個組成分 外光譜檢測兩者已不含蛋白質(zhì)、核酸等非多糖類物質(zhì)。純化后的淡紫擬青霉多糖同樣具有凝膠多糖的特性。 3、在對淡紫擬青霉胞內(nèi)、外多糖 分子結(jié)構(gòu)分析中，證明兩者均是以 13 葡萄糖苷鍵連接的單糖組分單一的無分支結(jié)構(gòu)的多聚葡萄糖；R 凝膠層析求得 品的平均分子量分別 為 果紅結(jié)合實驗結(jié)果表明 品在稀堿溶液中（濃度分支度（有無分支度、分支度大小） 單糖組成（均多糖或雜多糖、雜多糖中單糖種類多少）。 主鏈結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系 -（ 1大多數(shù)文獻(xiàn)報道的活性多糖都是 構(gòu)型的多聚糖則大多沒有生物活性或活性很弱，但是也有部分具有較強(qiáng)生物活性的 H. 3和 T. 4等人報道了一種 -（ 1外汪艷等人 25從稻糠中提取純化得到了一種具有 -（ 1 -（ 1苷鍵結(jié)構(gòu)，且具有較顯著抑制腫瘤生長作用的米糠多糖（ 。 在單糖的連接位置，具有 13 連接方式的多糖大多具有生物活性，部分 16連接方式的多糖也具有生物活性，而 12 連接、 14 連接等方式的多糖則很少具有活性。 構(gòu)型不同的葡聚糖其作用不同，一般認(rèn)為 -（ 13 ） -（ 14 ） -（ 13 ） 茯苓多糖和昆布多糖都有這種結(jié)構(gòu)，但 卻無抗腫瘤活性。以下是幾種目前正在臨床試驗和應(yīng)用的具有生物活性的食藥用真菌多糖及其基本結(jié)構(gòu) 26。 表 分食藥用真菌多糖 的 結(jié)構(gòu) 源 多糖 結(jié)構(gòu) 菇多糖（ L） -（ 13 ）； -（ 16 ）三股螺旋 芝多糖（ -（ 13 ）； -（ 14 ）； -（ 16 ）蛋白復(fù)合物 褶菌多 糖（ -（ 13 ）； -（ 16 ）三股螺旋 樹花多糖 -（ 13 ）； -（ 16 ）蛋白復(fù)合物 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 9 分支度與活性的關(guān)系 多糖分支度與活性的關(guān)系并不是一種線性關(guān)系，分支度適中的多糖往往具有較高的活性，而分支度過高或過低的多糖其活性都有限?；钚院軓?qiáng)的裂褶菌多糖和香菇多糖僅在 有分支，分支度為 自擔(dān)子菌類 分支度為 肉瘤 抑制率是裂褶菌多糖的 94%。另一些活性多糖的分支度分布為 變化較大。 7以及 伊藤和枝 28對幾 十種葡聚糖的分支度與其抗腫瘤活性進(jìn)行了比較，認(rèn)為分支度（ -（ 13 ） 有更高的活性。具有更高分支度的 （ 聚糖抗腫瘤活性是有限的。具有分支度的薄蓋靈芝（ 聚糖（ 僅具有微弱的活性29。表 3 是一些有生物活性的食藥用真菌多糖和它們的分支度 30。 表 3 部分食 藥用真菌多糖 的 分支度 of 源 多糖 分支度 苓多糖 苓多糖 菇多糖（ L） 樹花多糖 褶菌多糖（ 木耳 分子量與活性的關(guān)系 多糖的活性在很大程度上取決于其分子量大小。一般來說分子量在100200間的多糖片段有較高的生物活性，而相同來源的分子量在 51 0分子量大于 100裂褶多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，而其低分子量（ 80）下形成的凝膠不可逆 。 表 紫擬青霉 胞外及胞內(nèi)多糖粗提物的物理性質(zhì) of 品 溶解性 外觀 成膠性 蒸餾水 1N N 、酮、醚、 內(nèi)多糖 不溶 不溶 易溶 不溶 微溶 深褐色粉末 較強(qiáng) 胞外多糖 不溶 不溶 易溶 不溶 微溶 褐色粉末 較強(qiáng) 表 紫擬青霉 胞外及胞內(nèi)多糖粗提物的 化學(xué)性質(zhì) of 品 蒽酮試劑 劑 劑 酚 碘液 胞內(nèi)多糖 粗提物 藍(lán)綠色 紫紅色 玫瑰紅 藍(lán)色 橘紅色 不變色 胞外多糖 粗提物 藍(lán)綠色 紫紅色 玫瑰紅 藍(lán)色 橘紅色 不變色 淡紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的分離與純化 淡紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的分離 脫蛋白次數(shù)對多糖含糖量、含蛋白量及得率的影響見表 著脫蛋白次數(shù)的增多，所得到的胞內(nèi)、外多糖半純品中的含糖量增加， 含氮量減少。脫蛋白 3 次后，得到的半純化淡紫擬青霉 胞內(nèi)、外多糖 半純品中含糖量的增加幅度和含氮量的減少幅度都趨于平緩，此時胞內(nèi)、外半純品多糖 蛋白含 量分別為 而多糖的得率著隨著脫蛋白次數(shù)的增加持續(xù)減少。因此，淡紫擬青霉粗多糖的脫蛋白次數(shù)應(yīng)以 3 次為宜。 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 36 表 脫蛋白次數(shù)對淡紫擬青霉多糖分離的影響 of of on 蛋白次數(shù) 含糖量（ %） 含氮量（ %） 得率（ %） 胞內(nèi)多糖 胞外多糖 胞內(nèi)多糖 胞外多糖 胞內(nèi)多糖 胞外多糖 1 膠柱層析 淡紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖經(jīng)過 層析，分部收集液用酚 到的洗脫曲線見圖 圖可見，胞內(nèi)外粗多糖均含有多個不同分子量的組分，但以其中一個分子量較大的組分占絕對的優(yōu)勢地位，分別記為 洗脫峰也較為尖銳對稱。因此我們選擇對進(jìn)行這兩個組分進(jìn)行下一步的研究。 00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 21 . 41 . 61 . 80 20 40 60 80 100洗脫體積 ( m L )90圖 內(nèi)粗多糖 層析圖譜 of 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 37 00 . 511 . 522 . 530 20 40 60 80 100洗脫體積 ( m L )90圖 外粗多糖 層析圖譜 of R 凝膠柱層析 上一步得到的 分，分別經(jīng)過 R 柱層析，分部收集液用酚 到的洗脫峰依然為單一的對稱峰（如圖 收集主峰含糖部位，經(jīng)透析、醇析、冷凍干燥后得白色的胞內(nèi)外多糖樣品 0 40 60 80 100洗脫體積 (m L)90圖 內(nèi)多糖 品 R 柱層析圖譜 of R 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 38 0 40 60 80 100洗脫體積 (m L)90圖 外多糖 品 R 柱 層析圖譜 of R 品純度鑒定 品再次經(jīng) R 柱層析，實驗結(jié)果仍顯示為單一的對稱峰。驗證了 為分子量均一的多糖。 紫外吸收光譜的測定 品在 190800行紫外光譜分析，結(jié)果如圖 示。在 260 280長處均無顯著吸收峰，說明樣品中 已基本去除蛋白質(zhì)、多肽、核酸類等雜質(zhì)物質(zhì)。 圖 內(nèi)多糖 品 紫外掃描光譜 of 防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 39 圖 外多糖 品 紫外掃描光譜 of 結(jié)論 淡紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的提取 與性質(zhì)鑒定 淡紫擬青霉發(fā)酵液的胞內(nèi)、胞外物質(zhì)經(jīng)過醇析法加乙醇 3 倍后 ，得到大量的多糖粗提物。經(jīng)過驗證，該粗提物 具有多糖的常見顏色反應(yīng)。在濃硫酸存在時，加熱可以與。 作用，界面處呈現(xiàn)紅紫色環(huán) ；與酚 與蒽 酮試劑反應(yīng)可以生成藍(lán)綠色得復(fù)合物 ；多糖粗提物 在水解前與 示藍(lán)色 ； 水解后與 劑呈陽性反應(yīng)，產(chǎn)生棕紅色氧化亞銅沉淀 ； 與碘 、 碘化鉀無顏色反應(yīng) ；將 多糖 粗提物的水懸 濁液點于濾紙上，用 劑染色呈現(xiàn)玫瑰紅色斑點。 粗多糖不溶于水、酸和醇、酮、醚等常見的有機(jī)溶劑，能溶于堿液。多粗糖的懸濁液受熱或透析時 會形成凝膠狀，用玻璃棒不容易攪碎、破壞凝膠狀態(tài)，凝膠用堿溶解可以恢復(fù)溶液狀態(tài)，但高溫（ 80）下形成的凝膠具有不可逆性。 以上 理、化 性質(zhì) 表明淡紫擬青霉多糖符合 凝膠多糖的特性 ，因此初步推測為其為凝膠多糖 。 淡紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的 分離 脫蛋白 35 次后，可以脫去絕大多數(shù)蛋白，淡紫擬青霉粗多糖中的蛋白質(zhì)含量低于 并且可避免多糖的降解。 蛋白后流水逆向透析對去除色素、殘留的有機(jī)溶劑及其他小分子物質(zhì)有很好的效果。 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 40 淡紫擬青霉胞內(nèi)外粗多糖的 純化 脫蛋白后的多糖樣品往往還是不同 分子量多糖的混合物，本實驗采用凝膠柱層析操作，使多糖得到較好的分離和純化結(jié)果。純化后得到淡紫擬青霉胞內(nèi)、外粗多糖主成分 過紫外光譜檢測， 品不含蛋白質(zhì)、核酸等非多糖類物質(zhì)。 品為白色粉末，理化性質(zhì)與粗多糖相近，同樣具有凝膠多糖的特性。 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 41 第四章 淡紫擬青霉多糖的結(jié)構(gòu)分析 引言 多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，認(rèn)識和了解多糖的結(jié)構(gòu)有助于對其進(jìn)一步的開發(fā)利用。就多糖的一級結(jié)構(gòu)與其生物活性關(guān)系而言，多糖的糖組成和糖苷鍵類 型對其生物活性有一定影響，如細(xì)菌活性多糖一般是由葡萄糖構(gòu)成的，而且葡萄糖主鏈上的 -（ 1， 3） 是多糖類復(fù)合物的研究要比蛋白等的研究困難得多。因為單糖分子比氨基酸分子有更多的功能基團(tuán)，以單糖為單體聚合起來的寡聚物和多聚物，結(jié)合方式更多而分析分離的難度要更大，純化糖鏈樣品即使得到相對較純的樣品，實際上也不是一種單分子結(jié)構(gòu)，還包含有微不均一性。因而從同一生物材料出發(fā)分離純化而得的多糖，不同的實驗室也會有不同的結(jié)構(gòu)。 對于糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)方面的測定，主要涉及到復(fù)合物分子量的測定、糖鏈組成的測定、糖鏈的結(jié)構(gòu)分析以及糖昔鍵的確定等方面的內(nèi)容。 目前大多采用化學(xué)方法和物理方法結(jié)合，即可闡明某一多糖一級結(jié)構(gòu)的大致特征，而用于高級結(jié)構(gòu)分析的方法主要是物理方法，諸如 磁共振、電子衍射等 92。 表 糖 結(jié)構(gòu)測定常用的方法 of of 定項目 常用方法 分子量測定 凝膠層析（ 質(zhì)譜（ 蒸汽壓法 單糖組成和分子比例 薄層層析（ 氣相色譜（ 高效液相色譜（ 組成單糖為吡喃型或呋喃型 紅外光譜（ 連接次序 選擇性酸水解、糖苷酶順式水解、核磁共振（ -， 糖苷酶水解、核磁共振（ 紅外光譜（ 羥基被取代情況 高碘酸氧化、甲基化 譜（ 糖鏈 單糖與氨基酸組成、稀酸水解、肼解反應(yīng) 生防菌淡紫擬青霉多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析 42 由于實驗條件和時間所限，本章只對淡紫擬青霉胞內(nèi)外多糖主要組分 行了結(jié)構(gòu)方面的測定。 材料與方法 品分子量的測定 32 采用 R 凝膠層析柱， 脫，流速 24mL/h。取 系列 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖各 10于 5離子水中上柱，每 5集一管。酚 出現(xiàn)最大吸收時的體積為洗脫體積 以 000 測定柱外水體積 0 為橫坐標(biāo)， 縱坐標(biāo)，繪制 同濃度待測 品于同樣條件上柱洗脫，根據(jù) 0 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查算分子量。 品單糖組成分析 93 取多糖溶液 2 管， 100 水解 8h， 和，離心取上清，濃縮后作紙層析。以 葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照，乙酸乙酯：吡啶：水