密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 我國(guó)水稻主栽品種 樣性比較及水稻紋枯病抗性遺傳分析 SR a SR a I 摘 要 本研究應(yīng)用 子標(biāo)記 來(lái)分析我國(guó)水稻主栽品種的遺傳多樣性，并對(duì)水稻紋枯病抗性基因進(jìn)行了初步定位。主要研究結(jié)果如下： 0 個(gè) 記，比較分析了 151 份上世紀(jì) 50 年代和近 10 年我國(guó)常規(guī)稻主栽品種的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)有 39 個(gè)標(biāo)記具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)共檢測(cè)到 213 個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn) 2 11 個(gè)，平均 ；平均 因多樣性指數(shù)（ 圍在 。秈粳亞種間 樣性差異明顯，秈稻平均等位基因數(shù)（ 高于粳稻品種（ 比較 78份 50 年代與 73 份近 10 年水稻主栽品種的遺傳多樣性，秈、粳亞種表現(xiàn)出相近的變化趨勢(shì)，即 樣性指數(shù)和等位基因數(shù) 50 年代主栽品種高于近 10 年的。雖然 因多樣性指數(shù)的變化并不顯著 （秈稻： z = P = 稻： z = P = ，但等位基因數(shù)目的變化達(dá)到顯著值 （秈稻： z = P = 稻： z = P = 。 遺傳變異絕大部分 存在于兩時(shí)期內(nèi)，盡管時(shí)期間平均貢獻(xiàn)的遺傳變異僅占 但仍然達(dá)到 5的顯著水平；秈、粳亞種兩時(shí)期間平均貢獻(xiàn)的遺傳變異高于整個(gè)分析樣本，分別為 秈、粳亞種不同位點(diǎn)的遺傳分化程度也各不相同，秈稻和粳稻品種分別有 13 個(gè)和 11 個(gè) 點(diǎn)的等位基因在兩時(shí)期間差異顯著，而其余位點(diǎn)的遺傳變異則是因時(shí)期內(nèi)品種間的差而引起的。 74 份源于組合 葉秋的加倍單倍體（ 體，連續(xù)兩年進(jìn)行 4 重復(fù)的隨機(jī)區(qū)組田間實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用改進(jìn)的紋枯病人工接種鑒定方法，調(diào)查其紋枯病病級(jí)，結(jié)合該群體構(gòu) 建的分子標(biāo)記連鎖圖譜，運(yùn)用區(qū)間作圖法對(duì)抗紋枯病 行了定位。兩年在第 1 染色體的相鄰區(qū)間 2005 年）和 2006 年）上各檢測(cè)到了一個(gè)抗紋枯病 獻(xiàn)率分別為 2005 年）和 2006 年），第 1 染色體上檢測(cè)到的抗紋枯病 源于白葉秋。兩年在第 5 染色體上均檢測(cè)到一個(gè) 于相同的區(qū)間 不同位置，貢獻(xiàn)率分別是 2005 年）和 2006 年），而第 5 染色體上檢測(cè)到的抗性 自另一親本 根據(jù)上述研究結(jié)果， 表明近 10 年我國(guó)常規(guī)稻主栽品種丟失了一部分等位基因，水稻育種仍應(yīng)加強(qiáng)更廣泛的種質(zhì)親本的選擇；定位的紋枯病抗性 抗紋枯病分子標(biāo)記輔助育種具有積極的現(xiàn)實(shí)意義，通過(guò)多親本雜交，回交等雜交手段可將抗紋枯病數(shù)量性狀位點(diǎn)快速聚合于同一材料，能夠大大加速育種進(jìn)程，縮短育種年限。此外，該結(jié)果對(duì)于水稻抗紋枯病的材料篩選有指導(dǎo)作用。 關(guān)鍵詞：水稻，主栽品種， 傳多樣性，紋枯病抗性， e SR in as 1. SR to 51 950s in 0 Of 0 39 to be 9 a 13 of .5 a 1. an . SR a e. By of a e, it 950s e of 0 in a a z = P = z = P = e (z = P = z = P = P 950s 0 of by 3 1 a of in as 950s. be in 2. It a 74 DH an H in a in 005 006. by an of a in of A H. TL of by of TL TL in on , TL on by on 005 006 by TL on on in 005 006 on on of or ), 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 物遺傳多樣性研究進(jìn)展 . 1 物遺傳多樣性的研究意義 . 1 物遺傳多樣性的研究方法 . 1 物遺傳多樣性的統(tǒng)計(jì)方法 . 5 稻遺傳多樣性研究的立題依據(jù) . 8 稻抗紋枯病的研究進(jìn)展 . 9 原學(xué) . 9 性鑒定方法 . 10 源的篩選及抗性種質(zhì)創(chuàng)新 . 11 性機(jī)制 . 12 性遺傳機(jī)制 . 13 稻紋枯病抗性 . 15 病育種 . 16 在的問(wèn)題與展望 . 17 稻紋枯病抗性遺傳研究的立題依據(jù) . 18 第二章 我國(guó)水稻主栽品種 樣性的比較分析 . 19 料和方法 . 19 料 . 19 取和 析 . 19 據(jù)分析 . 20 果與分析 . 20 樣性 . 20 同時(shí)期的遺傳多樣性 . 22 期間的遺傳分化 . 22 論 . 23 第三章 水稻紋枯病抗性遺傳分析 . 25 料與方法 . 25 體構(gòu)建 . 25 取 . 25 衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè) . 26 據(jù)處理 . 28 枯病抗性處理及表型鑒定 . 28 果與分析 . 29 型變異分 布 . 29 V 子遺傳圖譜的構(gòu)建 . 30 紋枯病 位 . 30 論 . 32 第四章 結(jié)論 . 33 國(guó)水稻主栽品種遺傳多樣性的分析 . 33 國(guó)水稻紋枯病抗性遺傳分析 . 33 參考文獻(xiàn) . 34 致謝 . 42 作者簡(jiǎn)歷 . 43 文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱(chēng) 中文名稱(chēng) 子標(biāo)記輔助選擇 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 單序列重復(fù) 單序列長(zhǎng)度多態(tài)性 列特性擴(kuò)增區(qū)域 列標(biāo)簽位點(diǎn) 增片段多態(tài)性分析 變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn) 切擴(kuò)增序列多態(tài)性 量性狀位點(diǎn) 倍 單倍體 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 物遺傳多樣性研究進(jìn)展 物遺傳多樣性的研究意義 遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，任何一個(gè)物種都具有獨(dú)特的基因庫(kù)和遺傳結(jié)構(gòu)，同時(shí)在不同的個(gè)體間往往也存在著豐富的遺傳變異，由此構(gòu)成了生物的遺傳多樣性。廣義的遺傳多樣性是指所有生物攜帶的遺傳信息的總和。狹義的遺傳多樣性是指種內(nèi)基因的變化，包括種內(nèi)顯著不同的種群間或同一種群內(nèi)的遺傳變異（ 1992）。遺傳多樣性所指的主要還是種內(nèi)的遺傳變異，它是一個(gè)物種對(duì)人為干擾進(jìn)行成功反應(yīng)的決定因素。另外，種內(nèi)的遺傳變異程度同時(shí)也決定了其進(jìn)化的潛勢(shì)（ 1991）。 植物遺傳多樣性不僅包括在任何指定地區(qū)所栽培的植物種及其所有品種的全部基因遺產(chǎn)，而且還包括它們的野生種和半馴化種。這種遺產(chǎn)越多，即其生物多樣性越豐富，那么改良栽培品種或選育新栽培品種的潛力就越大。遺傳多樣性的表達(dá)是通過(guò)大量基因的組合或重組實(shí)現(xiàn)的，這些基因存在于某一生物種的個(gè)體之中，但在同一生物種的不同個(gè)體中卻表現(xiàn)出不同的特 性，如生長(zhǎng)方式、對(duì)寄生物或病原菌的抗性，對(duì)逆境的耐受性，以及生產(chǎn)力等。就農(nóng)作物而言，育種家可以利用其遺傳多樣性分離出具有所期望的特性的栽培品種。 物遺傳多樣性的研究方法 遺傳學(xué)研究常用的標(biāo)記有 形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記 和 子 標(biāo)記 （李俊清， 1998） 。無(wú)論采用哪種標(biāo)記進(jìn)行研究都是為了揭示物種的變異性，而且， 每一種新型遺傳標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)都大大地推動(dòng)了遺傳學(xué)的發(fā)展（方宣鈞， 2002）。 態(tài)標(biāo)記 形態(tài)學(xué)即表型性狀，是檢測(cè)遺傳變異最直 接 、最簡(jiǎn)便的方法。 狹義的形態(tài)標(biāo)記是指肉眼可見(jiàn)的外部特征特性，如植物的株高、 葉形、果實(shí)顏色等。從廣義上講形態(tài)標(biāo)記也包括與色素、生殖生理特性、 抗病抗蟲(chóng)性等 有關(guān)的標(biāo)記。形態(tài)標(biāo)記具有簡(jiǎn)便易行、直觀快速等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)，植物多樣性保護(hù)研究以形態(tài)標(biāo)記作為主要的或初步的指標(biāo)。但是形態(tài)標(biāo)記提供的遺傳信息有限，一些高度遺傳的特性通常在研究材料中表現(xiàn)出很小的變異，遺傳表達(dá)有時(shí)不太穩(wěn)定。另外，許多形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境、生育期等因素的影響，使其應(yīng)用受到限制。這些局限性導(dǎo)致了生物化學(xué)技術(shù)如同工酶和蛋白質(zhì)電泳（ ， 1957）和直接分析 平多態(tài)性的分子技術(shù)的發(fā)展。然而，形態(tài)標(biāo)記仍是不可能被任何分 子技術(shù)所取代的，分子或生化的研究結(jié)果應(yīng)與形態(tài)特征特性鑒定相中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 互補(bǔ)充（ ， 1997）。 胞學(xué)標(biāo)記 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記常見(jiàn)的 有 染色體的結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征，它們分別反映了染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的遺傳多 樣 性。染色體 結(jié)構(gòu)特征包括染色體的核型和帶型。核型特征是指染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)的位置 和隨體有無(wú)等，由此可以反映染色體的缺失、重復(fù)、倒位和易位等遺傳變異；帶型特征是指染色體經(jīng)特殊染色后，帶的顏色深淺、寬窄和位置順序等。 染色體數(shù)量特征是指細(xì)胞中染色體數(shù)目的多少，染色體數(shù)量上的遺傳多樣性包括整倍體和非整倍體變異，前者如多倍體，后 者諸如缺體、單體、三體、端著絲點(diǎn)染色體等。 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，但 是細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的數(shù)目十分有限 。另外，一些細(xì)胞學(xué)標(biāo)記常常伴有一些有害的表型效應(yīng)，從而限制了細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的應(yīng)用。 化標(biāo)記 研究蛋白質(zhì)多態(tài)性的最重要手段是同工酶電泳技術(shù)。同工酶是指具有同一底物專(zhuān)一性的不同分子形式的 酶 ，具有組織、發(fā)育及物種特異性。該技術(shù)的基本原理是根據(jù)電荷性質(zhì)差異，通過(guò)蛋白質(zhì)電泳或色譜技術(shù)和專(zhuān)門(mén)的染色反應(yīng)顯示出同工酶的不同形式，從而鑒別不同基因型。由于其方便經(jīng)濟(jì)，易于操作，受到廣泛應(yīng)用，特別在 物種起源和進(jìn)化研究、 種質(zhì)鑒定 以及動(dòng)植物群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中同工酶電泳分析已經(jīng)成為常規(guī)操作（ ， 1983； ， 2000； 2002） 。 以同工酶為標(biāo)記有以下優(yōu)點(diǎn)：與形態(tài)標(biāo)記相比，同功酶標(biāo)記受環(huán)境影響小，表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定；實(shí)驗(yàn)所需材料較少，可以反復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；同工酶位點(diǎn)是共顯性的，父母的基因型可以同時(shí)在后代中檢驗(yàn)出來(lái)。 但 其也 存在諸多不足，如 對(duì)電泳分析的樣品要求較高； 每一種同工酶標(biāo)記都需要特殊的顯色方法和技術(shù)； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨動(dòng)植物不同發(fā)育時(shí)期、器官及環(huán)境會(huì)有所變化 等。最關(guān)鍵的不足是 可以利用的遺傳位點(diǎn)數(shù)量比較少 ，尤其是在種內(nèi)品種間，同工酶的差異更少 ， 因此遠(yuǎn)不能滿足數(shù)量性狀定位和標(biāo)記輔助選擇育種等實(shí)際工作的需要。 子標(biāo)記 子 標(biāo)記本質(zhì)上是指能反映生物個(gè)體或種群基因組中某種差異特征的 段，也即基因型在 平上的表現(xiàn)形式。 子標(biāo)記 具有以下優(yōu)點(diǎn)：直接以 形式出現(xiàn)，沒(méi)有上位性效應(yīng)，不受環(huán)境及基因表達(dá)與否的限制； 能對(duì) 不同發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、任何組織器官，甚至細(xì)胞作檢測(cè)；多態(tài)性幾乎遍及整個(gè)基因組； 多態(tài)性高， 自然存在著許多等位變異，不需專(zhuān)門(mén)創(chuàng)造特殊的遺傳材料；表現(xiàn)為中性標(biāo)記，即不影響目標(biāo)性狀的表 達(dá)，與不良性狀無(wú)必然的連鎖；許多分子標(biāo)記為共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息（賈繼增， 1996；劉勛甲等， 1998；夏銘， 1999）；部分分子標(biāo)記可分析微量 古化石樣品。 近年來(lái)， 隨著基因組研究的不斷深入，分子標(biāo)記的研究和應(yīng)用也得到迅猛的發(fā)展。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 子標(biāo)記 根據(jù)檢測(cè)手段， 大致可分為三類(lèi)：第一類(lèi)是以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的標(biāo)記，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ 稱(chēng) of 變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)） 等。第二類(lèi)是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ 簡(jiǎn)稱(chēng) 應(yīng)）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的標(biāo)記，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 稱(chēng) 簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（ 稱(chēng) 列特性擴(kuò)增區(qū)域）、 序列標(biāo)簽位點(diǎn)（ 稱(chēng) 。第三類(lèi)是基于限制性酶切和 術(shù)的分子標(biāo)記，包括擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（ 稱(chēng) 酶切擴(kuò)增序列多態(tài)性（ 稱(chēng) 。 基于分子雜交的 記 最早發(fā)展的 子標(biāo)記（ ， 1974），至今仍被廣泛應(yīng)用。其 基本原理是利用限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割基因組 特 定位點(diǎn)，由于生物個(gè)體種群間酶切位點(diǎn)的差異，得到長(zhǎng)短、數(shù)目不同的限制性片段，這些片段經(jīng)凝膠電泳分離后，呈現(xiàn)不同的帶狀分布，通過(guò)與克隆的 針進(jìn)行 交和自顯影后，即可產(chǎn)生和獲得反映生物個(gè)體或群體特異的 譜。 由于基因組 堿基對(duì)的突變引起限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的增減，或是識(shí)別位點(diǎn)間發(fā)生堿基的互換、突變、插入、重排或缺失等變化導(dǎo)致限制性片段數(shù)目和長(zhǎng)度的變異。由于 堿基對(duì)的突變和重排很普遍，所以 數(shù)量很大（洪國(guó)藩， 1999）。常用的記探針主要來(lái)源于隨機(jī)的 基因組克?。?稱(chēng) 隆）和 優(yōu)點(diǎn)是：生物體 遍存在；大多數(shù)為中性突變；標(biāo)記呈孟德?tīng)栠z傳，不存在上位性或多效效應(yīng)，不受環(huán)境影響；共顯性；結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。上述優(yōu)點(diǎn) 記特別適用于構(gòu)建連鎖圖，迄今為止，已在水稻、玉米、番茄、馬鈴薯、小麥等 20 余種作物上構(gòu)建了 譜，并在不斷的飽和圖譜上的標(biāo)記。同時(shí)也成為分析群體內(nèi)和群體間的遺傳變異度、群體間基因流以及譜系和親緣關(guān)系的強(qiáng)有力工具。但 存在明顯的缺點(diǎn)： 所需的 較 大 ； 操作繁瑣， 又需要昂貴的生化試劑， 成本高；所需 態(tài)性探針不易獲得；多態(tài)檢出效率低，只能檢測(cè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上的變異，能提供的信息有限等。 基本原理與 致相同，只是對(duì)限制性內(nèi)切酶和 針有特殊要求，限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)必須不在生物基因組的重復(fù)序列中，以保證小衛(wèi)星（重復(fù)單元核心序列 670和微衛(wèi)星（重復(fù)單元 1 6序列的完整性；分子雜交所用的 針是小衛(wèi)星序列或微衛(wèi)星序列。 次可檢測(cè)到的基因座可達(dá)幾十個(gè)，但與 樣，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，成本高。 基于 記 核心是 段的變性 延伸循環(huán)反應(yīng)： 變性：以微量的 模板，在高溫變性條件下，雙鏈解成單鏈。 復(fù)性：在復(fù)性溫度下，寡核苷酸引物與單鏈 的互補(bǔ)堿基結(jié)合。 延伸：在延伸溫度下，經(jīng)聚合酶的作用，以引物為起始合成互補(bǔ)的 。經(jīng)過(guò)多中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 次循環(huán)，當(dāng)一對(duì)引物結(jié)合部位間的距離在一定范圍內(nèi)時(shí)，能擴(kuò)增出若干以引物序列為兩端的 于不同生物個(gè)體基因組 基變異，導(dǎo)致寡核苷酸引物結(jié)合部位的序列改變，或者一對(duì)引物相鄰兩個(gè)結(jié)合部位之間發(fā)生插入、缺失或其它重新排列，則同 一對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度發(fā)生變異，因此， 以作為分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。 與 比，它所需要的 較少，可檢測(cè) 平，不需要同位素，安全性好；較便宜，快速易行，易于自動(dòng)化。目前應(yīng)用較多的有 標(biāo)記。 記 :是第一種廣泛應(yīng)用于生物遺傳變異性檢測(cè)和基因定位的 記， 原理是利用一個(gè)隨機(jī)序列的寡核苷酸作引物（通常為 10 個(gè)核苷酸），以基因組 模板，通過(guò) 應(yīng)非定點(diǎn)擴(kuò)增 斷，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè) 列的多態(tài)性。 記在基因組研究方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)（ ， 1990； ， 1990） ： 基因型分析 不需 針，設(shè)計(jì)引物也不需要知道序列信息；技術(shù)簡(jiǎn)單， 析不涉及 交、放射自顯影或其它技術(shù)；不 像析， 析只需少量 品；用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段 ， 檢測(cè)多態(tài)性快；成本較低，因?yàn)殡S機(jī)引物可在公司買(mǎi)到，其價(jià)格不高 。 記檢測(cè)靈敏、方便，多態(tài)性強(qiáng)，可以檢測(cè)出 記不能檢測(cè)的重復(fù)序列區(qū)，可填補(bǔ) 譜的空缺，適用于遺傳多樣性檢測(cè)、種質(zhì)資源鑒定和分類(lèi)、目標(biāo)性狀基因的分子標(biāo)記、遺傳圖譜的快速構(gòu)建等。 記 存在的 缺點(diǎn) 是 不穩(wěn)定， 重 現(xiàn) 性 差 ， 可靠性 不太高 ， 因?yàn)樵?應(yīng)中條件的變化會(huì)引起一些擴(kuò)增產(chǎn)物的改變 ；此外， 記為顯性標(biāo)記，不能有效 鑒別雜合子 ，因此不能提供完整的信息。 原理與 術(shù)相似的標(biāo)記技術(shù)還包括 意引物引導(dǎo)的 記。 術(shù)是利用非常短的隨機(jī)引物（ 一般為 5 8 個(gè)核苷酸 ）擴(kuò)增不同個(gè)體的 后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色檢測(cè) 。 用引物比 ，因而擴(kuò)增產(chǎn)物更多，但其 定性比 低。 記較長(zhǎng)，通常為 18 24 個(gè)核苷酸，穩(wěn)定性比 ，但揭示多態(tài)性的能力比 。 記 : 亦稱(chēng)微衛(wèi)星標(biāo)記或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（ 由幾個(gè)核苷酸（ 2 5 個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè) 核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列 如（ n，（ n，（ n 等，在染色體上呈隨機(jī)分布，由于重復(fù)次數(shù)不同及重復(fù)程度的不完全 而造成了每個(gè)座位的多態(tài)性（ ， 1989） 。不同研究者對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記重復(fù)單元的長(zhǎng)度有不同定義，包括 1-5 1-6 2-6 2-8 （ ， 2000），微衛(wèi)星 術(shù)則是根據(jù)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物進(jìn)行增，經(jīng)電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)短的變化，揭示不同個(gè)體在每個(gè) 點(diǎn)上的多態(tài)性（ ， 1989； ， 1989； ， 1989）。 記的優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示多態(tài)性高 ；具有等位基因的特性，提供的信息量大；呈共顯性；每個(gè)位點(diǎn)位置由設(shè)計(jì)的引物決定，便于相互交流，目前已廣泛用于種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、 紋圖譜構(gòu)建以及標(biāo)記輔助選擇、連鎖圖繪制等（ ， 1994；袁力行等， 2000； 等， 1997；劉 峰 等， 1999）。它的缺點(diǎn)是必須針對(duì)每個(gè)染色體座位的 定并找到其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需要投入大量的人力、物力。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 記在野生稻和栽培稻中都具有極高的多態(tài)性檢測(cè)能力（ ， 1993； ， 1993；， 1994； ， 1997）。目前已定位的水稻微衛(wèi)星標(biāo)記已達(dá) 2000 余個(gè)（ 2002）并公布于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中 (從而使微衛(wèi)星標(biāo)記在水稻分子標(biāo)記和 基因定位 中得到廣泛的應(yīng)用 。 記 :記 是在 術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，由于 穩(wěn)定性較差，為了提高 記的穩(wěn)定性，先對(duì)基因組 析，然后將目標(biāo) 段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序，根據(jù) 段兩端序列設(shè)計(jì)特定引物（ 一般比 物長(zhǎng) ，通常 18 24 以此引物對(duì)基因組 段 進(jìn)行 異性擴(kuò)增，從而鑒別原 段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)( ， 1993)。 記由于所用的引物較長(zhǎng)且引物序列和模板 全互補(bǔ)，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下擴(kuò)增，結(jié)果穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng) ， 且一般呈 共顯性遺傳。 基于限制性酶切和 術(shù)的 子標(biāo)記 記 :是由 （ 1993） 發(fā) 明 ，其基本原理是對(duì)基因組 可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生大小不同的酶切片斷，與含有共同粘性末端的人工接頭連接，作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板。 引物的結(jié)合部位是接頭以及與之相連的酶切片段中的幾個(gè)堿基序 列。因此，引物由三部分組成： 與人工接頭互補(bǔ) 的 核心堿基序列 ； 限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列 ； 引物 3 端的 2或 3 個(gè)選擇性堿基 序列 。只有那些兩端序列能與選擇性堿基配對(duì)的限制性片段才能被擴(kuò)增。由于接頭和引物是人工合成的，因此，不需要在事先知道 列的前提下，可以擴(kuò)增酶切片段；應(yīng)用選擇性堿基，則可將一次擴(kuò)增控制在 50 100 條帶。 質(zhì)上是 結(jié)合的技術(shù)，集 兩 者優(yōu)點(diǎn) 于一體，既具有 可靠性，也有 敏性。 記所需的 少，檢測(cè)快速，通用性強(qiáng)，因此被認(rèn)為是目前一種十分理想、有 效的分子標(biāo)記（鄭敏 等 ， 1999；王志林等， 2001）。據(jù)報(bào)道水稻 記多態(tài)性較高，其基因組分布又較隨機(jī)（ ， 1996； 1997； ， 1998）；短短幾年內(nèi)，已應(yīng)用于水稻遺傳變異性分析、框架圖譜構(gòu)建和基因定位等各個(gè)領(lǐng)域（ ， 1996；， 1997； ， 1997； ， 1998； ， 1998）。不過(guò)， 要用同位素檢測(cè)，費(fèi)用昂貴，對(duì)操作人員素質(zhì)及 量要求較高。 記 :又稱(chēng) 實(shí)質(zhì)上是 合的一種方法。 其基本步驟是：先進(jìn)行 增，然后將 增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切，再用瓊脂糖凝膠電泳將 段分開(kāi)。 當(dāng) 增片段不表現(xiàn)多態(tài)時(shí)，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切 ， 從而增加了檢測(cè)多態(tài)性的機(jī)會(huì)，記揭示的是特異 段的限制性長(zhǎng)度變異的信息（ ， 1993）。 物遺傳多樣性