密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小麥白粉菌誘導(dǎo)早期的基因表達(dá)分析 o. I 摘 要 由白粉菌 C 引起的小麥白粉病是我國小麥生產(chǎn)中的嚴(yán)重病害。它可導(dǎo)致大規(guī)模的糧食減產(chǎn)，嚴(yán)重地威脅著我國的糧食 安全 。因此，迫切需要應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法從整體水平上深入研究抗病機(jī)理，以尋找提高抗性的行之有效的方法。 在本研究中，為了從整體水平上研究 抗病相關(guān)基因的表達(dá)情況，我們利用抑制差減雜交的方法構(gòu)建了小麥抗白粉病的 庫。以誘導(dǎo)的 等基因系為實(shí)驗(yàn)方，以其輪回親本未誘導(dǎo)的 驅(qū)動(dòng)方。根據(jù) 本實(shí)驗(yàn)室 李愛麗 等 對(duì)白粉菌侵染 小麥 細(xì)胞學(xué)的研究 （ 2005, In 以及相關(guān)文獻(xiàn) 我們確定了 1、 3、 6、 12、 16、20種后小時(shí) ) 7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)為取材時(shí)間點(diǎn)。 所構(gòu)建 庫 中 共保存了 4224 個(gè)克隆， 提取了 864 個(gè) 質(zhì)粒 , 將質(zhì)量好的 667 個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序， 共獲得 637 條 質(zhì)量好的表達(dá)序列標(biāo)簽 )。 在 用 合 件對(duì)其進(jìn)行序列同源性比對(duì)。結(jié)果表明 共有 373 條 有蛋白質(zhì)編碼功能 ， 254 條 碼產(chǎn)物與已知蛋白質(zhì)序列同源性較低或找不到任何同源序列 ,將 這 254 條 中比對(duì)，發(fā)現(xiàn) 6 條新 在 373 條具有蛋白編碼功能的序列中，有 74 條序列編碼未知蛋白， 經(jīng)過 進(jìn)一 步篩選 得到 207 條 據(jù) 結(jié)果進(jìn)行功能注釋， 以及根據(jù)998)對(duì) 擬南芥基因的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了功能的分類。 在 所獲得小麥白粉菌誘導(dǎo)早期表達(dá)的基因中 ， 已知功能的 同源 基因涉及多種代謝和應(yīng)答過程，如初級(jí)代謝、能量代謝、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、信號(hào)識(shí)別、抗病防御、蛋白質(zhì)合成、加工以及次級(jí)代謝等。與相同材料白粉菌誘導(dǎo) 24、 48、 72基因表達(dá) 情況 （駱蒙等， 2002）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示誘導(dǎo) 24前的 基因 表達(dá)中，抗病基因上游的 R 基因 表達(dá)較多， 占抗病 /而誘導(dǎo) 24后的基因表達(dá)中，此類基因所占比例較小， 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基因大量富集 ，占 所分析基因 的 12%，是 誘導(dǎo) 24后的 基因 表達(dá)中 此類基因比例的兩倍。其中， 相關(guān)信號(hào)分子、泛素降解相關(guān)蛋白表達(dá)較多，尤其是 26S 蛋白酶體相關(guān)蛋白以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白僅在誘導(dǎo) 24前的 基因 表達(dá)中發(fā)現(xiàn)。相比之下， 誘導(dǎo) 24后的 基因 表達(dá) 的特點(diǎn)是 系統(tǒng)獲得性抗性相關(guān)基因以及防衛(wèi)基因的表達(dá)較為豐富。通過對(duì) 本實(shí)驗(yàn)中 基因 表達(dá) 的 分析 并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)可以看出， 某些信號(hào)傳導(dǎo)類，胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)類，轉(zhuǎn)錄因子 類，次生代謝類，以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)類 基因在多種植物材料和多種脅迫誘導(dǎo)中均 有 表達(dá)。這似乎暗示著植物對(duì)于外界環(huán)境脅迫的基礎(chǔ)防御機(jī)制的一致性。 最后，本研究針對(duì) 24前誘導(dǎo)表達(dá)的基因情況，對(duì)小麥抗白粉病可能的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。 關(guān)鍵詞 ：小麥， 近等基因系， 抗白粉病， 庫，基因表達(dá) 分析 ，抗病機(jī)制 is a of is by C. It So it is to at to in In a by on as a of of a m2 as a is to by C) in we to of 1, 3, 6, 12, 16, 20 i et (2005, In 64 to be 73 or 4 254 to 207 in As a 4in SH 4, 48, 72et 2002), of of 12% of in SH 4 In 26S In SH 4 of , 6% of of R(to a of in SH in of to in of on of 錄 摘 要 . 一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 物抗病性研究概況 . 1 物的抗病性 . 1 物抗病基因的克隆及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn) . 2 物抗病機(jī)制及抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑 . 5 麥抗白粉病基因的研究進(jìn)展 . 10 麥抗白粉病基因的研究背景 . 10 麥抗白粉病基因克隆的研究現(xiàn)狀 . 11 麥抗白粉病機(jī)制的研究 . 11 制差減雜交的原理和應(yīng)用 . 13 理 . 13 術(shù)評(píng)價(jià) . 13 術(shù)的應(yīng)用 . 14 題意義和技術(shù)路線 . 16 題意義 . 16 術(shù)路線 . 17 第二章 材料與方法 . 18 物材料及處理 . 18 提取 . 19 提取 . 19 純化 . 20 庫的構(gòu)建 . 20 一鏈 成 . 20 二鏈 成 . 20 酶切 . 21 頭的連接 . 22 一次雜交 . 24 二次雜交 . 24 次 增 . 25 物的連接轉(zhuǎn)化 . 26 減差異片段 庫的構(gòu)建 . 27 入片段檢測(cè) . 27 粒的提取 . 27 增克隆的插入片段 . 27 序 . 28 序質(zhì)粒的提取 . 28 序反應(yīng) . 28 序反應(yīng)產(chǎn)物純化 . 29 序結(jié)果分析 . 30 第三章 結(jié)果與分析 . 31 檢測(cè) . 31 切結(jié)果 . 31 頭連接效率 . 32 制性差減雜交結(jié)果 . 32 減雜交效率檢測(cè) . 33 減文庫庫容和插入片段的 增 . 34 序結(jié)果 . 35 列分析和功能注釋 . 35 誘導(dǎo) 24、 48、 72 小時(shí)的差減文庫的比較 . 44 類功能的基因所占比例的比較 . 44 抗病反應(yīng)全過程來看兩個(gè)差減庫的差異 . 46 第四章 討 論 . 48 種脅迫反應(yīng)的共性 . 48 白粉病識(shí)別機(jī)制初探 . 48 A 信號(hào)途徑在抗病反應(yīng)作用中的可能性 . 49 烯在抗病反應(yīng)作用中的可能性 . 49 抗病反應(yīng)作用中的意義 . 49 泛素降解相關(guān)的可能機(jī)制 . 50 第五章 結(jié) 論 . 51 參考文獻(xiàn) . 52 致 謝 . 60 作者簡歷 . 61 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 物抗病性研究概況 自人類文明開始 以來 ，植物病害 就 對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 產(chǎn)生 巨大影響，進(jìn)而威脅人類生存。 同時(shí) 植物病害總是造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失 和 資源 的 浪費(fèi)。 18 世紀(jì) 40 年代的馬鈴薯晚疫病 的流行導(dǎo)致了整個(gè)愛爾蘭的大饑荒即是一例。人口的日益增長以及耕地的逐漸減少迫使人類必須想盡辦法保證世界糧 食 的 穩(wěn)定供給。雖然殺蟲劑的使用成功地控制了病害，但是它們持續(xù)和日益擴(kuò)大的使用將嚴(yán)重危害人類的健康和生存環(huán)境。 此外， 高產(chǎn)作物品種的應(yīng)用也可以提高產(chǎn)量，但是卻帶來了風(fēng)險(xiǎn) ，即 如此大面積種植的遺傳背景一致的品種極易 發(fā)生 破壞性的流行病。這一切都在告訴我們，只有深入探討植物自身抗病機(jī)制并結(jié)合當(dāng)今世界復(fù)雜的病害發(fā)展生態(tài)學(xué)研究才能夠 找到 防御植物病害的最好方法（ et 1997）。 物的抗病性 在紛繁蕪雜的生態(tài)圈中存在著大量的病原物，如病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲等，但是只有相對(duì)較少的病原物能夠成功 地 侵染寄主細(xì)胞并導(dǎo)致病害（ et 1997）。這是因?yàn)樵陂L期的進(jìn)化過程中，它們與病原物相互影響，相互作用，甚至協(xié)同進(jìn)化，從而逐漸獲得了一系列防御機(jī)制來保護(hù)自己。 這種機(jī)制既有專一性的抗性 ,也有非專一性的抗性；有組成型表達(dá)的，也有誘導(dǎo)型表達(dá)的抗性。植物的抗病性可總結(jié)為四類 非寄主抗性、非小種?；钥剐浴⑿》N?；钥剐约盎A(chǔ)防御（表 1 表 1礎(chǔ)抗病內(nèi)容 （ et 2003） et 2003） 術(shù)語 (解釋（ 抗病性表現(xiàn)（ 非寄主抗性 （ 抗病發(fā)生在種間，有效抵抗所有已知病原 無癥狀 非寄主專化性抗性（ 抗病性發(fā)生在種內(nèi)，有效抵抗所有已知病原， R 蛋白介導(dǎo) 僅有某些植物基因型表現(xiàn)完全抗性 小種專 化性 抗性 （ 抗病性在種內(nèi)有所變化，僅在 植物具有 R 蛋白，同時(shí)受到病原體?；孕》N產(chǎn)生相應(yīng)激發(fā)子的情況下有效抵抗 每一植物基因型表現(xiàn)出對(duì)不同病原菌分離小種不同的抗病性及感病性 基礎(chǔ)防御（ 在病原成功侵染后阻止病原的生長擴(kuò)大 感病性在不同的感病基因型中有所變化 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 物抗病基因的克隆及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 為了抵御自然界不計(jì)其數(shù)的病原種類的侵襲，植物逐漸演化出一組抗病基因 (R) 來識(shí)別和應(yīng)答病原中互補(bǔ)的無毒基因（ 早期的遺傳研究認(rèn)為 R 基因編碼高度選擇性的受體來檢測(cè)病原的存在。這些受體的激活打開了在某種寄主抗性中 設(shè)置的信號(hào)通路的開關(guān)（ ., ., 2002）。 近十幾年來，世界上的許多實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過艱苦卓絕的努力 ，目前已 從 12 種植物或作物當(dāng)中鑒定出了 44 個(gè) R 基因（表 1 表 1克隆的 R 基因 et 1996 et 1995 M et 1997 P et 2000 et 1997 et 1999 et 1998 et 1996 et 1994 et 1998 et 1998 et 2000 et 2000 (et 1999 et 2000 et 1996 et 1998 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 ri et 1997 et 1999 et 1999 ai et 1999 et 1998 et 2000 et 2000 et 1998 et 2000 et 2001 et 2003 et 2003 et 2003 et 2004 et 1994 et 1996 1998 ai et 1997 et 1993 et 2002 et 1995 un et 2004 C et 2001 et 2001 et 1992 et 1997 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 細(xì)胞介素受體結(jié)構(gòu)域； 苷 酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域； 亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域； 胞外 富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域； 膜結(jié)構(gòu)域； 白激酶； 脯氨酸谷氨酸絲氨酸蘇氨酸序列位點(diǎn)； 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞信號(hào)結(jié)構(gòu)域。 1 這些 R 基因抵御細(xì)菌、病毒、真菌、卵菌甚至線蟲和昆蟲等無論胞內(nèi)或胞外的不同生命形式的病原物。盡管這些病原物的種類很廣，并且可能的致病機(jī)理也很不相同，但是已經(jīng)克隆的 R 基因卻僅僅編碼主要的五類蛋白質(zhì) (圖 1。 最大的一類 R 基因編碼一個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（ 富亮氨酸重復(fù)（ 白家族( 這一類蛋白一般存在于細(xì)胞質(zhì)中 ，但是至少有一種 白是與質(zhì)膜相關(guān)的（ et 1998）。它們最吸引人的結(jié)構(gòu)特征是 C 端 量的變化。不同類型的蛋白質(zhì)常具有不同數(shù)量的 構(gòu)，行使不同的生物大分子之間結(jié)合的作用。此類蛋白常帶有特定的 細(xì)胞介素受體（ 構(gòu)域等類型。 第二類具有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外的 構(gòu) ( 如番茄抗葉霉病不同生理小種的基因 甜菜抗包囊線蟲的 因，其產(chǎn)物都是錨定于細(xì)胞膜上的糖蛋白受體 ,它們的 而在 第三類是蛋白激酶類（ 如番茄 因 , 其產(chǎn)物是一個(gè)位于細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸 它沒有 構(gòu)域，但是可能通過其 N 端的豆蔻?；稽c(diǎn)與膜相關(guān)聯(lián)。大麥 因編碼的蛋白則包含兩個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域。 第四類是 跨膜結(jié)構(gòu)域 加 胞外 胞內(nèi)蛋白激酶類（ 如水稻抗白葉枯病基因 產(chǎn)物 。 第五類是新克隆的 編碼產(chǎn)物 的 N 端帶有信號(hào)錨（ 結(jié)構(gòu)并且與CC(構(gòu)相 融合。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 圖 1種主要的抗病基因編碼的蛋白的代表性位置和結(jié)構(gòu)（ et 2001） 1of of of （ et 2001） 除 上述 五類之外 ， 最特殊的是最早克隆到的抗病基因玉米 R 基因 它負(fù)責(zé)對(duì)真菌種 1 的抗性。它編碼依賴于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 ( 還原型輔酶 ) 的 , 活 種 1 產(chǎn)生的致病因子 , 它決定該病菌只能感染玉米的某些基因型 (et 1992) 。另外，大麥抗白粉?。?f. 因 是不符合上述模式的抗病基因。該基因編碼的蛋白中含有至少 6 個(gè)跨膜 蛋白螺旋（ , 但沒有其它 R 基因的類似結(jié)構(gòu)。最近發(fā)現(xiàn)的一類特殊類型是番茄抗病基因 們包含一個(gè)胞外 構(gòu)域，并連有一個(gè)與蛋白降解相關(guān)的 構(gòu)域 (僅在 發(fā)現(xiàn) ) 以及一個(gè)短蛋白結(jié)構(gòu)域，其功能可能是靶定受體介導(dǎo)的內(nèi)吞（ 白（ et 2003）。 物抗病機(jī)制及抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑 別機(jī)制 1971 年 出 基因?qū)?的 假說，揭示了植物的抗病性是由植物的抗病基因 (R 同源的病原物的無毒基因 (產(chǎn)物相互作用，既而引起下游一系列的抗病信號(hào)的表達(dá)和傳遞 ,最終 導(dǎo)致抗性。然而，當(dāng)時(shí)對(duì)于 R 產(chǎn)物與 物的具體識(shí)別機(jī)制并不清楚。之后的近 30年的研究，使我們對(duì)這種識(shí)別機(jī)制 可 見一斑。 1981 年 先提出抗病基因和無毒基因產(chǎn)物的直接相互作用構(gòu)成了基因?qū)?的 抗性。這種由經(jīng)典的受體 所示。 對(duì) 大量的 R 基因的克隆及其產(chǎn) 物結(jié)構(gòu)分析表明 R 蛋白在結(jié)構(gòu)上存在相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦裕饕譃槲孱悾ㄉ衔奶岬剑?，迄今為止最大的一類編碼氨基端為 或 細(xì)胞介素受體（ 構(gòu)域，中間的 羧基端的富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（ 個(gè)部分融于一體的蛋白。這些基因在這里叫做 在這一類中，識(shí)別特異性決定部分在 ，在這一結(jié)構(gòu)域中假定的暴露在外的疏水殘基位點(diǎn)是高度變化的，因此，推測(cè) et 2003）。這似乎成為人們證實(shí) 直接相互作用 的依據(jù)。然而，以后的研究表明，這種識(shí)別機(jī)制并不是最初想象得那么簡單。例如， 型的抗病基因產(chǎn)物 其同源的無毒因子 間的相互作用并不能引發(fā)下游信號(hào)。相反， 受體似乎是 種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的不帶任何特定受體結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶（ et 1996;et 1996）。此外，第二大類編碼具有細(xì)胞外 構(gòu)域的蛋白，這是一類來源病原物配體的潛在受體（ et 1997）。然而，對(duì)此類抗病基因的代表 相互作用的研究中并沒有中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 6 發(fā)現(xiàn)二者之間直接的作用（ et 2001）。直到 2000 年， 體外酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)才證實(shí)了導(dǎo)致抗病反應(yīng)的 抗病基因與無毒基因產(chǎn)物之間的直接相互作用。也就是說，雖然直接的識(shí)別機(jī)制早以提出，后來也確實(shí)證明了這種假說在某些植物抗病中的正確 性 ，但是，大量的研究和證據(jù)表明，這種直接的識(shí)別機(jī)制是較少發(fā)生的，目前僅證實(shí)了兩種： et 1996）和 ia et 2000)。 圖 1原無毒基因產(chǎn)物與植物抗病基因產(chǎn)物的相互作用 (et 2003) vr et 2003) 假定的病原物 (灰色 )附著到植物細(xì)胞上，并表達(dá)了一系列的致病蛋白 (紅色 )。 這些 蛋白通過第三類分泌機(jī)制 (對(duì)細(xì)菌來說 ) (et 2001)或其它未知機(jī)制 (真菌線蟲等 )被轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi)。一旦進(jìn)入它們就靶向結(jié)合寄主蛋白 (綠色 )來控制防御應(yīng)答、代謝或其它植物細(xì)胞中影響病原物致病的生理過程 (注意致病蛋白也可能結(jié)合胞外蛋白 )。 (a) 在這種模式中植物細(xì)胞不能表達(dá) R 蛋白來識(shí)別致病蛋白。因此，植物不能有效地探測(cè)到病原物，防御最多微弱地被誘導(dǎo)。 (b)這種模式描述了經(jīng)典的受體 R 蛋白直接結(jié)合到致病蛋白上。這種識(shí)別事件激活了一種復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，并隨之引發(fā)防御應(yīng)答。 (c) 這種模式描述了保鏢假說，即 R 蛋白 (保鏢 )探測(cè) 被修飾的寄主蛋白 (保衛(wèi)物，以紅星表示 )，這種修飾蛋白可能以一種和侵入的致病蛋白形成的復(fù)合物形式出現(xiàn)。 當(dāng)前，隨著大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)的積累，一種稱為 保鏢假說 的間接識(shí)別機(jī)制已成為研究者們廣泛討論的熱點(diǎn)。這種假說最早是由 人在研究為什么 白激酶在與無毒因子中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 7 別中需要 型的蛋白 激活抗性時(shí)提出的（ et 2001）。在這種模式中， R 蛋白實(shí)際上與細(xì)菌第三類因子（ II 其他細(xì)菌因子在寄主細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)物相 聯(lián)系。這種目標(biāo)物可能是某種植物抗病組分，或者是能被致病因子修飾從而滋養(yǎng)胞外細(xì)菌的寄主蛋白。一般說來，當(dāng)?shù)谌愐蜃舆M(jìn)入抗病的寄主細(xì)胞，與其目標(biāo)物相互作用，形成的復(fù)合體被R 蛋白所識(shí)別，從而引發(fā)抗性。在特異 R 蛋白不存在的時(shí)候，寄主體內(nèi)的目標(biāo)物不能被保護(hù)從而使第三類因子的致病作用得以發(fā)揮，植株隨之感病。例如， 寄主抗性中普遍存在的組分，可能存在于應(yīng)答植物病原細(xì)菌非?；ぐl(fā)子的路徑中。其無毒因子 作用是鎖定 阻止非?；烙窂健?一種 的蛋白保衛(wèi)著 測(cè)無毒因子 破壞作用，然后激活抗性（ et 2001）。 保鏢假說 雖然沒有被證實(shí)，但是它在人們過去一直持有的簡單的 R 蛋白與無毒蛋白直接相互作用的觀念上前進(jìn)了一步。為人們最終弄清識(shí)別機(jī)制 提供 了嶄新的思路。 圖 1鏢假說中 R 蛋白的作用 （ et 2001） et 2001） 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 8 (a) 一 種細(xì)胞蛋白復(fù)合物 （ 藍(lán)色 ） ，包含保衛(wèi)物 （ 分子 （ 紅色 ） 和一個(gè) 白 （ 灰色， N 端以深色陰影表示 ） 是細(xì)菌第三類致病因子 （ 橘紅色 ） 的 目標(biāo)物。 (b) 第三類因子與復(fù)合物結(jié)合后，釋放并激活 白，從而導(dǎo)致抗 病性。 (c)或者， 白開始不是目標(biāo)復(fù)合物的一部分，直到第三類因子結(jié)合 后才也結(jié)合上去。 (d) 第三類因子與目標(biāo)物的結(jié)合激活了 白。 前已知的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 R 基因識(shí)別后的早期事件是鈣離子流，胞外堿性增強(qiáng)，蛋白