密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 外源基因定向插入甘藍(lán)型油菜 C 基因組的研究 I 摘 要 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的環(huán)境釋放導(dǎo)致外源基因擴(kuò)散到其野生近緣種形成超級(jí)雜草已引起人們廣泛關(guān)注。加拿大已經(jīng)在野生白菜種群中發(fā)現(xiàn)了抗除草劑外源基因。因此，轉(zhuǎn)基因油菜的生態(tài)安全研究重點(diǎn)應(yīng)在降低轉(zhuǎn)基因向其近緣種擴(kuò)散的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)上，而降低外源基因向 油菜生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)蕓薹屬物種間相互雜交的細(xì)胞遺傳學(xué)研究成果，甘藍(lán)型油菜與白菜和芥菜類植物間有同 源 的 無 同 源 的 色體 。因此，甘白或甘芥雜種在與 染色體重組過程中 有 與其 同 源 的 染色體配對(duì) 而 很容易丟失， 即 當(dāng)外源基因位于甘藍(lán)型油菜 本研究通過將 因組中，以轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)（ 2n=18）與非轉(zhuǎn)基因白菜（ 2n=20）正反交， 以 人工合成不同胞質(zhì)甘藍(lán)型油菜（ 2n=38）的方式，獲得 對(duì)獲得的 胞遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)基因遺傳、花粉育性及農(nóng)藝性狀等研究。主要研究結(jié)果如下： 1. 通過對(duì)影響芥藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化的各個(gè)條件，如再生體系、外植體種類、農(nóng)桿菌菌液濃度及共培養(yǎng)時(shí)間等參數(shù)的優(yōu)化研究，建立了高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的芥藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化體系，以子葉為外植體的最高轉(zhuǎn)化頻率達(dá)到了 以下胚軸為外植體的最高轉(zhuǎn)化頻率為 2. 通過白菜和轉(zhuǎn) 用子房培養(yǎng)和胚培養(yǎng)的方法人工合成了分別具有白菜和甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)的 建立了不同胞質(zhì)人工合成甘藍(lán)型油菜的胚培養(yǎng)體系。 以白菜為母本的正交共獲得 75個(gè)人工合成油菜株系，雜種苗誘導(dǎo)率（ 反交獲 4個(gè)株系，雜種苗誘導(dǎo)率（ 3. 31個(gè)株系是轉(zhuǎn)基因陽性株系；對(duì)轉(zhuǎn)基因芥藍(lán)及人工合成油菜進(jìn)行基因組 位于人工合成的甘藍(lán)型油菜 4. 對(duì) 人工合成的甘藍(lán)型油菜減數(shù)分裂行為觀察結(jié)果表明， A、 減數(shù)分裂前期表現(xiàn)分裂速度存在差異，在后期，末期以及第二次減數(shù)分裂過程中很少出現(xiàn)染色體的異常配對(duì)現(xiàn)象。而人工合成油菜最初幾代的染色體結(jié)構(gòu)變化可能更多的來源于基因組內(nèi)部的易位和重組。 5. 白雜種（ 34%以下）和甘芥雜種（ 28%以下）的育性都低，但甘白雜種的生存適合度高于甘芥雜種。甘白雜種與白菜回交一代的抗性轉(zhuǎn)基因植株比例為 與 步表明外源基因在 續(xù)研究工作還在進(jìn)行之中。 關(guān)鍵詞 向轉(zhuǎn)基因；人工合成甘藍(lán)型油菜；白菜；基因擴(kuò)散；染色體減數(shù)分裂行為；轉(zhuǎn)基因安全 A of is to in . to is a of . of of to of . - is B. . a of in A C of is or to . . . 2 . as . by of on as as of as 1. By as of of of so a of 2. of 75 a PR in PR a PR 3. 5 of . in 31 6 PT of of in . to as 4. of . It is in of as , a to 5. of It of of 4% 8% in C1 a to et s. It is 錄 摘 要 . . 英文縮略表 . 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 言 . 1 桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展 . 2 外植體再生體系的建立 . 2 農(nóng)桿菌 濃度及 浸染 時(shí)間 . 4 農(nóng)桿菌的活化 . 4 外 植體與農(nóng)桿菌共培條件 . 4 玻璃苗的控制 . 5 目前較成熟的甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化體系 . 6 工合成甘藍(lán)型油菜研究進(jìn)展 . 7 蕓苔屬屬內(nèi)種間關(guān)系 . 7 人工合成 甘藍(lán)型 油菜研究 . 8 人工 合成 甘藍(lán)型油菜 的鑒定 . 9 人工 合成 甘藍(lán)型 油菜的利用 . 9 基因甘藍(lán)型油菜向其近緣種的基因 擴(kuò)散 . 10 甘藍(lán)型油菜的近緣種 . 11 開花期和空間重疊 . 11 花粉傳播距離 . 11 雜交親和性 . 12 雜交和回交后代的育性及適應(yīng)性 . 13 成功的基因 漂移 . 14 小結(jié)與展望 . 15 止轉(zhuǎn)基因 擴(kuò)散 的策略 . 16 雄性不育策略 . 16 孤雌生殖策略 . 17 構(gòu) 的利用 . 17 母體遺傳策略 . 17 . 17 特異 染色體組 轉(zhuǎn)基因 . 17 研究的背景和意義 . 18 V 第二章 芥藍(lán) 的遺傳轉(zhuǎn)化 . 20 言 . 20 料和方法 . 20 驗(yàn)材料 . 20 驗(yàn)方法 . 21 果與分析 . 23 桿菌介導(dǎo)的芥藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化 . 23 . 25 論 . 26 第三章 C 染色體組轉(zhuǎn) 因甘藍(lán)型油菜的人工合成 . 28 言 . 28 料與方法 . 28 驗(yàn)材料 . 28 驗(yàn)方法 . 29 果與分析 . 32 菜細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的人工合成 . 32 藍(lán)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的人工合成 . 32 種染色體加倍效率 . 35 色體觀察 . 36 成油菜的 農(nóng)藝性狀表現(xiàn) . 36 基因檢測(cè) . 37 粉育性觀察 . 37 成轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜 . 38 藝性狀表現(xiàn) . 38 粉育性 . 39 論 . 40 第四章 人工合成油菜減數(shù)分裂中的染色體行為觀察 . 42 言 . 42 料與方法 . 43 果與分析 . 44 論 . 44 第五章 C 基因組轉(zhuǎn)基因油菜 向 白菜、芥菜 基因 擴(kuò)散 規(guī)律初步研究 . 47 言 . 47 料與方法 . 48 驗(yàn)材料 . 48 驗(yàn)方法 . 48 果與分析 . 49 1 分析 . 49 1 分析 . 51 . 52 論 . 53 第六章 全文結(jié)論 . 55 參考文獻(xiàn) . 56 附 錄 . 66 致 謝 . 67 作者簡(jiǎn)歷 . 68 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 酰丁香酮 6 云金芽孢桿菌 芐青霉素 孢 霉素 六烷基三甲基溴化銨 氯異氰尿酸 高 辛 2, 4,4， 4霉素 in 因組原位雜交 種獲得率 哚丁酸 哚乙酸 那霉素 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 密度 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 粉母細(xì)胞 乙烯吡咯烷酮 制片段長(zhǎng)度多態(tài)性 二烷基硫酸鈉 NA i E 沖液 瘤質(zhì)粒 5 維生素 米素 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 言 油菜 具有 適 應(yīng)性強(qiáng)、用途廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、發(fā)展?jié)摿Υ?等特點(diǎn)，是世界上種植 面積 和 總產(chǎn) 僅次于大豆 的 第二 大油料作物。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局國(guó)際統(tǒng)計(jì)信息中心統(tǒng)計(jì)， 2000年全世界油菜收獲面積為 104產(chǎn)量為 104t，平均單產(chǎn)為 1472kg/中國(guó)是世界上油菜種植、加工、消費(fèi)大國(guó)， 常年 種植面積 約 1億畝（ 667萬 公頃 ） ，年產(chǎn)量 約 1000萬噸 ，居世界第一位 。 而且，當(dāng)前隨著對(duì)能源需求的日益增加，隨著 生物柴油 產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，必將推動(dòng)作為生物柴油的理想原料 油菜產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步的快速發(fā)展 。 植物基因工程技術(shù)打破了物 種之間的生殖隔離，使遺傳物質(zhì)在動(dòng)物、植物和微生物三界之間進(jìn)行交流，利用此技術(shù)可在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，創(chuàng)造新的種質(zhì)，開辟了新的植物育種的新途徑。 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國(guó)際服務(wù)組織（ 布 的 2005年度 報(bào)告 指出，自 1996年 轉(zhuǎn)基因 作物首次商 業(yè) 化以來，全球 轉(zhuǎn)基因 作物種植面積從當(dāng)初的 6國(guó) 170萬公頃增加到 2005年的 21國(guó)9000萬公頃 ， 2005年 比 2004年增加了 11%。世界轉(zhuǎn)基因作物的總市值 也在 不斷增加， 2005年轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜等 4種主要轉(zhuǎn)基因作物的總市值已經(jīng)達(dá)到 計(jì) 2006年將突破 55億美元。 報(bào)告指出， 混合基因產(chǎn)品將成為未來的發(fā)展趨勢(shì)。 2005年，美國(guó)已開始種植第一種 3基因產(chǎn)品 玉米。 中國(guó)從 1997年開始批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物，到 2005年，轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)到330萬公頃。 油菜是農(nóng)藝學(xué)上的名詞，凡是栽培的十字花科（ 薹屬（ 物用以收籽榨油的，統(tǒng)稱為油菜。因此，油菜不是一個(gè)單一的物種，當(dāng)今世界各國(guó)栽培的主要是甘藍(lán)型油菜（ 是目前轉(zhuǎn)基因植物中研究最多的一類植物。自 1996年轉(zhuǎn)基因油菜批準(zhǔn)環(huán)境釋放以來，已經(jīng)從 1996年 的 10萬公頃增加到 2005年的 460萬公頃。在國(guó)外 ， 至少有 77個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品種已經(jīng)在加拿大等國(guó)商業(yè)化生產(chǎn) 。 商業(yè)化轉(zhuǎn)基因油菜的分布主要在加拿大和美國(guó) 。 近年來，加拿大轉(zhuǎn)基因油菜面積達(dá) 油菜 總面積的 70%。 美國(guó)油菜種植面積也在逐年增大，轉(zhuǎn)基因油菜的面積約占 30%左右 。 我國(guó)目前還沒有轉(zhuǎn)基因油菜的商業(yè)化種植，但油菜的轉(zhuǎn)基因研究相當(dāng)活躍，油菜的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)比較成熟。油菜轉(zhuǎn)基因研究已有幾十例成功報(bào)道，有的已進(jìn)入環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)階段 。 浙江省農(nóng)科院培育的轉(zhuǎn)基因油菜 “超油 1號(hào)”和“超油 2號(hào)”已 順利完成中試和環(huán)境釋放試 驗(yàn) 。同時(shí)也允許轉(zhuǎn)基因油菜籽作為原料的進(jìn)口 。 孟山都公司的抗農(nóng)達(dá)（草甘膦）品種 個(gè)抗除草劑品種 (和 于 2004年通過我國(guó)安全評(píng)估并獲得加工原料進(jìn)口許可。因此，如何降低轉(zhuǎn)基因油菜的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)已成為我們當(dāng)前中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 迫切需要解決的重要課題。 桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是甘藍(lán)類蔬菜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化最常用最成熟的一種方法。 1985)利用野生型根癌農(nóng)桿菌感染甘藍(lán)的莖最早得到轉(zhuǎn)化植株。 (1988)使用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)最先獲得花椰菜轉(zhuǎn)基因植株。 1989)利用發(fā)根農(nóng)桿菌首先獲得了羽衣甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株。芥藍(lán)、青花菜和抱子甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株的首次獲得也均是基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的。 葉和下胚軸，建立了青花菜和甘藍(lán)良好的轉(zhuǎn)化體系，外植體最高轉(zhuǎn)化率是 10。毛慧珠 (1996)等以帶柄子葉作為外植體，將 轉(zhuǎn)化頻率很低，被侵染的外植體中只有 5可在抗性培養(yǎng)基上分化成苗。李大力等（ 2002）通過甘藍(lán)下 胚軸與根癌農(nóng)桿菌 含 25黃科等（ 2005）建立了青花菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 然而，這其中的許多報(bào)道在基因轉(zhuǎn)移或植株再生中的一個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)中仍然存在未能克服的問題，許多體系仍然存在著一些不足。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)類蔬菜的遺傳轉(zhuǎn)化效率與許多因素，如外植體的基因型、取材部位、取材時(shí)間、再生培養(yǎng)基、農(nóng)桿菌浸染濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、延遲培養(yǎng)基、延遲培養(yǎng)時(shí)間、選擇培養(yǎng)基、抗生素的使用等都有較大的關(guān)系。 植體再生體系的建 立 再生體系對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。外植體對(duì)再生條件的要求，特別是對(duì)培養(yǎng)基中激素配比的要求會(huì)因外植體生理狀態(tài)不同而發(fā)生變化，而其生理狀態(tài)又與基因型、外植體種類、取材部位、苗齡、生活力、生長(zhǎng)條件等有關(guān)。因此，在進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化再生時(shí)，由于農(nóng)桿菌的侵染、抗生素除菌和篩選，會(huì)使外植體的生活力明顯減弱，而對(duì)再生的激素配比及其他再生條件要求也可能發(fā)生一定的變化。但一般認(rèn)為，當(dāng)外植體再生效率高時(shí)，則會(huì)增加轉(zhuǎn)化效率。 1997）研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)化率可能依賴于高再生力和高感染率。因此，建立良好的外植體再 生體系仍然是提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的有效途徑。目前，對(duì)轉(zhuǎn)化再生的研究主要通過兩步進(jìn)行，首先建立再生體系，然后再研究侵染農(nóng)桿菌后外植體的培養(yǎng)條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。 植體 外植體的基因型、苗齡、培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)時(shí)間等都會(huì)影響外植體的再生效率。一般認(rèn)為，當(dāng)外植體再生效率高時(shí)，則會(huì)增加轉(zhuǎn)化效率。 外植體的品種基因型對(duì)芽分化的影響十分顯著。 大量研究表明：植物的不同基因型品種是制約其分化能力的重要因素（楊廣東， 2002b；李聰， 1989）。 1997）的研究認(rèn)為基因中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 型是轉(zhuǎn)化中最重要的因素。 我們對(duì) 30個(gè)甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜品種進(jìn)行的再生實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，基因型對(duì)再生頻率影響較大（待發(fā)表）。因此在遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)前，一般進(jìn)行再生預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行在特定培養(yǎng)基條件下的品種篩選，以確定再生頻率高的品種從而進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。 不同的外植體的分化頻率與取材時(shí)間也有較大相關(guān)性。當(dāng)以子葉為外植體時(shí)，則取 4當(dāng)以下胚軸為外植體時(shí)，以 5 7革志等（ 2001），衛(wèi)志明等（ 1998）研究認(rèn)為，以下胚軸為外植體時(shí)，取 6 7淑平等（ 2002）以夏光甘藍(lán)的父母 本為受體研究認(rèn)為， 5 6科等（ 2005）對(duì)青花菜的再生研究結(jié)果表明，培養(yǎng) 7 中以 7的下胚軸誘導(dǎo)不定芽的頻率最高，為 100%，苗齡少于 6 張七仙和敖光明（ 2001）以 6個(gè)甘藍(lán)品種為轉(zhuǎn)化受體的研究認(rèn)為，甘藍(lán)外植體的長(zhǎng)度和培養(yǎng)天數(shù)對(duì)愈傷組織的形成影響很大：下胚軸太長(zhǎng) (1.0 太短 (0.1 不利于愈傷組織的形成，即使有愈傷組織形成，但分化芽很難，而 組織，其中生長(zhǎng) 4d 80均可形成抗性愈傷組織；對(duì)于子葉，無論大小，在這種培養(yǎng)基上其愈傷組織都很難形成愈傷組織形成的難易，在 6個(gè)品種之間差別不大。 養(yǎng)基 一般采用 作為基本培養(yǎng)基，對(duì)于芽的分化還要附加一定的激素，常用生長(zhǎng)素 (細(xì)胞分裂素 (6一定量配比。一般利用組培篩選得到的最佳培養(yǎng)基應(yīng)用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。但王曉峰等 (2000)在多個(gè)甘藍(lán)品種上的試驗(yàn)表明子葉柄和下胚軸受農(nóng)桿菌侵染后再生比常規(guī)組培需要較高的生長(zhǎng)素濃度 。 衛(wèi)志明等（ 1998）以 103和 60天早椰菜 的下胚軸進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中分別含有.5 ， .0 ， .1 或 .0 ， .0