分類號： 單位代碼： 10389 密 級： 學 號： 建農林大學碩士學位論文 生防菌 番茄 及土壤 中 定殖特性 的 研究 學 科 門 類：農學 一級學科名稱：植物保護 二級學科名稱：植物病理學 研 究 方 向：植物病害生物防治 研 究 生： 指 導 教 師： 完 成 時 間：二 0 一 0 年四月 he on of in 2010 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位（畢業(yè)）論文，是本人在指導教師的指導下獨立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果 。與我一同對本研究做出貢獻的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識產權的行為，由本人承擔應有的責任。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權的說明 本人完全了解福建農林大學有關保留、使用學位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學校有權送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱 ， 學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨热荩梢圆捎糜坝?、縮印或其他復制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權書。 不保密，本論文屬于不 保密。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導教師親筆簽名： 日期： 福建農林大學碩士論文 i 目錄 中文摘要 . I . 一章 綜述 . 1 1 番茄青枯病的生物防治 . 1 2 番茄青枯病拮抗細菌的研究進展 . 1 3 生防菌定殖機制的研究進展 . 2 防菌的定殖研究進展 . 2 防菌對植株生理特性影響的研究進展 . 3 防菌 對植株根際微生態(tài)影響的研究進展 . 4 防菌定殖土壤微生態(tài)的研究 . 5 4 本研究的目的及意義 . 5 第二章 生防菌 其 記菌異質性比較 . 6 1. 引言 . 6 2. 材料與方法 . 6 料 . 6 法 . 6 3. 結果與分析 . 7 其標記菌株 形態(tài)觀察 . 7 其標記菌株 生長曲線測定 . 8 其標記菌株 最適 試驗 . 8 其標記菌株 驗室抑菌率試驗 . 9 4. 討論 . 11 第三章 生防菌 番茄植株內的定殖 . 12 1. 引言 . 12 2. 材料與方法 . 12 料 . 12 法 . 12 3. 結果與分析 . 12 番茄植株內的定殖觀察 . 13 番茄植株內的定殖濃度 . 14 4. 討論 . 15 第四章 生防菌 番茄生理及根際微生物的影響 . 16 1. 引言 . 16 2. 材料與方法 . 16 料 . 16 法 . 17 3. 結果與分析 . 20 番茄生理生化特性的影響 . 20 番茄根際微生物的影響 . 23 番茄根系生長的影響 . 25 福建農林大學碩士論文 . 討論 . 26 第五章 不同性質土壤中定殖特性 研究 . 27 1. 引言 . 27 2. 材料與方法 . 27 料 . 27 法 . 27 3. 結果與分析 . 28 壤理化性質的測定 . 28 種土壤中 數量動態(tài)變化 . 29 土壤中微生物種群的影響 . 30 分析 土壤微生物群落結構的影響 . 38 4. 討論 . 43 第六章 生防菌 番茄青枯病的防效測定 . 44 1. 引言 . 44 2. 材料與方法 . 44 料 . 44 法 . 44 3. 結果與分析 . 45 同濃度 91 號青枯雷爾氏菌液對番茄的致病試驗 . 45 其 記菌株對番茄青枯病的防效測定 . 46 4. 討論 . 46 第七章 結論與展望 . 48 1 結論 . 48 2 特色 . 48 3 展望 . 48 附錄 . 55 個人簡歷 . 63 致 謝 . 64 福建農林大學碩士論文 I 中文摘要 采用 激光共聚焦顯微鏡 技術， 對 青枯病生防菌 記菌株 在番茄 植株內的定殖 進行 跟蹤 觀察， 測定 了 番茄植株內不同部位的定殖濃度， 首次確定了 該菌 的內生定殖特性， 宜 在番茄植株內定殖， 其 在根內的定殖濃度最高，達 104g， 在 莖部 、 葉片內 的定殖 濃度遞減。 研究了 番茄 葉綠素、可溶性蛋白含量 和 性 以及 根際微生 物 的影響，結果表明： 番茄葉綠素 有短期效應，處理后第 5 天葉綠素 a、 30 天與對照 幾乎沒有 含量差 ，處理后第 10 天葉綠素含量 a/b 的值明顯低于對照，其后趨于一致；對 可溶性蛋白含量以及 性未產生明顯影響，能顯著提高番茄根系 性； 理后番茄根際 細菌、真菌、放線菌數量有所下降 。 研究了 記菌株在不同土壤中的定殖消 長動態(tài)，分別用稀釋涂板法和脂肪酸生物標記法（ 析了 定殖對土壤微生物的影響 ，包括 生物標記總量和 微生物 群落結構的影響，結果表明： 不同土壤中定殖濃度不同，在各土壤中定殖時間 均 超過 160 天 ； 理后，各 處理 土壤中微生物的變化趨勢 復雜 ，細菌、真菌 種類和數量均高于處理前，且在第 32 天高于對照 ； 析 結果顯示 ，各處理土壤中脂肪酸生物標記總量均高于對照 ，各處理土壤中的微生物處于動態(tài)變化過程，總體趨勢來看， 理后土壤中真菌、細菌、放線菌特征性磷脂脂肪酸標記量高于對照組。 對 其 記菌株 栽條件下對 番茄青枯病的 生防效果進行了測定，結果表明， 108、 106 度的 可以推遲番茄青枯病的 發(fā)生，有較高的防效， 108 校正防效分別為 100 %、 ， 106 校正防效 均 為 。 關鍵詞： 生定殖，消長動態(tài)，土壤微生物，生防效果 福建農林大學碩士論文 of of in in of in in in a 04g, in to of of as of a of no on 0th b 0 no to of of in of in to in 60 as of 08, 106 mL to of a 08 mL 00 %, , 06 mL . 1 第一章 綜述 番茄（ 是茄科茄屬番茄 亞屬 的多年生草本植物 ，品種眾多，是重要的果蔬之一，國內外都有大面積種植 。 隨著科學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)番茄具有豐富的營養(yǎng)和抗癌物質 1但番茄的產量和質量受多種病蟲害的影響，其中番茄青枯病已成為影響番茄生產的主要障礙之一 。 1 番茄青枯病的生物防治 番茄青 枯病 是 由青枯雷爾氏菌（ 起的 一類土傳性性細菌病害 4，寄主范圍廣，可侵染危害 50多個科的數百種植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū) 5,6，在我國南方各省危害也十分嚴重，流行年份造成大面積減產，品質下降，特別在番茄結果期，適逢高溫高濕的雨季，可引起毀滅性的危害。 番茄青枯病的防治是一大世界難題，國際上每 4年舉行一次細菌性青枯病學術研討會對其進行廣泛的討論與交流 7，可見國內外科學家對青枯病的高度重視。對于植物青枯病的防治研究，國內外一直是以綜合防治為主 8。早期專家們將重點放在抗病育種 9上，但目前為止，具有抗青枯病性能的作物品種很少，而且抗性 容 易丟失；利用嫁接方法防治番茄青枯病雖獲得成功，但因技術難度大而導致推廣和普及困難 10；輪作在一定程度上能夠較好地防治青枯病 11，但受地理環(huán)境的影響，也難以大面積推廣 12；化學農藥防治雖有一定的防效，但 青枯雷爾氏菌在土壤中存活時間長、傳播快，小種分化型復雜 13 迄今為止還沒有一種理想的農藥可以防治青枯病 7，加之 隨著化學農藥使用量的日益增大， 易產生抗藥性 、農藥殘留、污染環(huán)境等負面影響越來越 引起人們的關注 。生物防治具有對生態(tài)環(huán)境友好、不易產生抗性、有利于人畜安全等優(yōu)點，使得人們將目光逐漸轉向青枯病的生物防治。常用于青枯病生物防治的主要因子有無致病力青枯菌 16拮抗細菌 19,20、轉基因作物 21菌根真菌 24、誘導抗性 7以及生態(tài)有機肥 25。 2 番茄青枯病拮抗細菌的研究進展 在番茄青枯病的生物防治中，拮抗細菌的利用一直是國內外學者的研究熱點，而且也篩選到了不少在實驗室內對青枯菌有明顯抑制作用的菌株，迄今國內外文獻中出現(xiàn)了許多關于拮抗細菌防治植物青枯病的相關報道 26涉及到的生防細菌主要有假單胞菌（如熒光假單胞菌 29、洋蔥假單胞菌等）、鏈霉菌 30、芽孢桿菌（如多粘類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌 31、短芽孢桿菌等）等。 芽孢桿菌 由于能產生抗逆性極強的芽孢， 要求營養(yǎng)簡單，繁殖速度快等優(yōu)點32， 從而更有利于商品化菌劑的生產、運輸和保存，并且相對于其它細菌類和真菌類的菌劑，其與化學農藥復配使用的相容性更好并且使用效果較為穩(wěn)定， 使其福建農林大學碩士論文 2 成為篩選青枯菌拮抗細菌的重點來源 33,34。目前 用于防治青枯病試驗的芽孢桿菌有：多粘芽孢桿菌 5、枯草芽孢桿 菌 36,37、蠟狀芽孢桿菌 38、巨大芽孢桿菌 9等。 迄今為止，國內外學者已經對番茄青枯病的拮抗細菌的篩選以及防效測定做了大量研究。 1990）用三株生防菌分別進行多種作物青枯病的防效試驗，其中一株對番茄青枯病的溫室試驗分別為 95 ，但是田間分別只有 36 40。 黎起秦等 37（ 2005）研究了不同接種方法對內生芽孢桿菌 果表明，接種 7 治效果為 ；同時接種 為 。將 番茄青枯病的室內防效為 ，田間防效為 。魏春妹等（ 2000）發(fā)現(xiàn)了對茄科類作物青枯病有良好防效并且具有促生作用的菌株 901。鄭福慶等（ 1998）從廣東省不同地方、不同作物的根圍及根際土壤中，篩選到對番茄青枯病菌具抑菌效果的菌株 20個 8，盆栽試驗結果表明，這些菌株可推遲番茄青枯病發(fā)生 10治效果高達 80 %。趙健等（ 2006）通過含菌平板抑菌圈測定法從健康番茄植株內篩選到了 3株對番茄青枯雷爾氏菌有較強拮抗作用的細菌42，其中 3。胡青平等 43利用濾紙片法從番茄莖內篩選到一株對番茄青枯雷爾氏菌抑菌圈達 2.5 雖然對青枯病生防菌的篩選以及防效研究是國內外學者研究的熱點，也 有不少關于青枯病生防菌的報道，在實驗室內或小區(qū)試驗中均有很好的抑制作用， 但目前為止生防產品由實驗室向大田推廣應用的并不多，生防制劑多為活菌制劑，在田間的作用體系、作用方式尚未明了，田間應用 時容易受到土壤性質、土著微生物、外界溫濕度等 44種因素影響，對生防制劑的不穩(wěn)定性難以解釋，從而無法控制 其田間防治效果。因此，應加強生防菌作用機制的研究，探索生防菌在施用環(huán)境中與病原菌、植物的互作機制是有效發(fā)揮生防菌作用效果的必要途徑。 3 生防菌定殖機制的研究進展 防菌的定殖研究進展 探究生防菌在施用過程中的定殖特性及其作用機制對于提高生防效果以更好的應用于生產意義重大。多數生防菌在實驗室內有很高的抑菌活性，但是在田間應用時防治效果卻不理想，這就要求研究者在研究生防菌自身理化性質的基礎上，進一步研 究生防菌與病原菌的互作、生防菌與施用環(huán)境的互作、生防菌與作物的互作，以便發(fā)揮生防的更佳效果。首先生防菌能否很好的在土壤或植株中定殖是能否較好的發(fā)揮防效的關鍵問題。 關于生防菌定殖機制的研究國內外也有不少報道。對于生防菌在植株內的定殖研究方法也有多種。有許多學者通過抗生素平板篩選突變菌株的方法 48生福建農林大學碩士論文 3 防菌的定殖以及生防特性進行研究。龍良鯤等 48研究了抗 200 g/霉素及 100 g/福平的自發(fā)突變菌株 01番茄根莖內的定殖，胡軍華等 49通過逐步提高藥物濃度獲得了抗 300 g/霉素的對煙草青枯病菌拮抗活性穩(wěn)定的銅綠假單胞菌 對其在煙草根、莖、葉內的定殖能力進行了研究。 運用現(xiàn)代分子生物學技術基因標記方法 也是許多學者研究的熱點。 利用標記好的生防菌接種植物，可以很直觀地觀察到生防菌是否進入了植物體，不同生防菌的侵染特性及其動力學、侵入部位、在宿主中的定殖部位以及在植物的整個生活史的動態(tài)變化，實現(xiàn)研究過程的可跟蹤化。 張淑梅等 52利用黃綠熒光蛋白基因和氯霉素抗性基因標記生防枯草芽孢桿菌得到標記菌株 對該菌株在黃瓜植株各部位的定殖能力、種群動 態(tài)及其在根圍的分布進行了研究。 （ 1998）以 作為選擇標記，用基因槍法進行了 T. 株1295遺傳轉化，并以帶標記基因的轉化子研究了該菌在匍匐葦草根際和葉面的定殖和分布情況。 綠色熒光蛋白（ 發(fā)現(xiàn)為研究植物和微生物之間的關系提供了一個極為有效的技術方法 53。它不需要像免疫膠體金標記那樣復雜雜的處理和 樣加入底物的反應過程，而是用活體材料在激發(fā)光的作用下，用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對 記菌株進行實時檢測 54。 2000）以 導法進行了 T. 遺傳轉化，并用篩選出的待標記基因的穩(wěn)定轉化子檢測了該生防菌在土壤中的定殖和生長。因其具有檢測方便、熒光穩(wěn)定、無毒害、可進行活細胞定時定位觀察等優(yōu)點 55，在研究微生物與環(huán)境、宿主相互作用、基因表達調控等方面得到廣泛的應用，并展現(xiàn)出良好的應用前景。 稀釋涂板法作為一種傳統(tǒng)的研究方法因操作簡單被廣泛采用。掃描電鏡和熒光顯微鏡也是常用的 檢測工具 56,57。苗則彥等（ 2009）研究了 黃瓜內生生防菌 58，得出結論，土壤中施入的 體能夠進入黃瓜根系，并可以向植株的莖、葉轉移和定殖。菌體濃度對該菌的定殖數量影響很大，濃度越高，在根、莖、葉中定殖數量越高，反之則低。齊飛飛等（ 2008）將發(fā)光酶 因轉移到棉花根際促生芽孢桿菌中，用根盒試驗對標記菌株在棉花根際的定殖動態(tài)進行了追蹤 59。 隨著綠色熒光蛋白標記的應用日漸廣泛，激光共聚焦顯微鏡也越來越廣泛的應用到植物病害生物防治領域 60 2006）研究了根際同時接種致病力和無致病力鐮刀菌在番茄根際中的定殖以及土壤中的分布 63，利用激光共聚焦顯微鏡觀察到了菌體在番茄根部的定殖 。 防菌對植株生理特性影響的研究進展 植物本身就是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，生防菌的引入會引起植物怎樣的反應？促進還是抑制植物生長？這都是在生防菌的使用之前有必要探究的問題。對于生福建農林大學碩士論文 4 防菌定殖后對植株影響的報道也有不少。自從 1978 年提出根際促生細菌（ 定義以后 64，國內外相繼報道了許多根際促生細菌 65，已報道的有熒光假單胞菌、芽孢桿菌 、根瘤菌等 20 多個屬的的根際微生物。它們多具有促進植物生長，改善土壤和植物微生態(tài)環(huán)境，增強植物抗病性等作用 66,67。 葉綠素、可溶性蛋白含量是鑒定植物生長狀態(tài)的常用指標 68,69， 植物中參與各種代謝活動的防御酶類活性的變化情況與植物抗病性關系密切 70， 氧化酶系的活性也被當作植物抗性相關因子而經常作檢測指標 71,72。 關于植物生理生化各項指標的測定均有多種方法，葉綠素的測定有丙酮法、 95 %乙醇法，最常用的可溶性蛋白測定方法是考馬斯亮藍法， 紫外分析法操作簡單 ，也得到不 少 學者的青睞。關于 活的測定方法最常用的分別是 創(chuàng)木酚法 、兒茶酚法 ，但是測量者經常根據所測樣本特點而稍作改進 。 周曉慧等（ 2007）研究了甜瓜蔓枯病抗性與 性變化的關系，結果表明，抗病品種 性高于感病品種 73。 張曉鹿等（ 2008）研究了不同接種條件下辣椒疫病生防菌的定殖及其對辣椒生長以及抗性誘導的影響 74，結果表明生防放線菌與生防真菌混合接種可以提高辣椒葉片 性，而降低根系 性，至于葉片 性的提高 是否意味著抗性增強而根系 梁軍鋒等（ 2005）研究表明75，接種生防放線菌后，辣椒葉片多酚氧化酶 (苯丙氨酸解氨酶 (活性均會提高，對辣椒的誘導抗性有顯著影響，但是該放線菌不能在辣椒根系定殖，放線菌與辣椒疫霉混合接種可促進放線菌定殖，且對辣椒葉片 性的提高幅度大于單獨接種。許英俊等（ 2008）報道了 3 株放線菌對草莓的促生作用以及對 性的影響， 可以提高草莓根系 性，對增強抵抗草莓根系根區(qū)病原菌侵染有一定效果 76。 防菌對植株根際微生態(tài)影響的研究進展 根際微生態(tài)是由植物 微生物組成的一個動態(tài)變化的生態(tài)系統(tǒng) 77。受到多種因素的影響。而生防菌能否很好的定殖于植物根際土壤，并且與植物以及根際微生物達到一個平衡狀態(tài)，是生物菌能否很好防治土傳病害要考慮的一個重要因子。 張偉瓊等（ 2007）研究表明，熒光假單胞菌只有在它們成功地在根際定殖后才能對抑制病害的發(fā)生真正起作用 78。 生防菌作為一種外來菌源施入土壤中很好的定殖以后又會對土壤中的微生物產生什么影響呢？ 郭志英等（ 2008）研究了 生防菌苗床接種對辣椒根域微生態(tài)及產量的影響 79，結果表明，接種生防菌后促使辣椒根域土壤中微生物類型由真菌型向細菌型轉變，細菌和放線菌數量明顯增加，而真菌數量減少。張昕等（ 2007）報道了引入黃瓜根圍的兩株生防菌株的生態(tài)效應 80，施入生防菌株對土壤中細菌福建農林大學碩士論文 5 種群數量有短期影響，隨著黃瓜生育期的延長，引入生防菌土壤中細菌數量與對照持平。而處理期間，引入生防菌對黃瓜根圍真菌與放線菌數量未產生明顯影響。劉國坤等（ 2009）報道了淡紫擬青霉 株對根際真菌群落結構的影響 81，該菌與蝦殼粉混合施用可以提高土壤真菌種群多樣性。 防菌定殖土壤微生態(tài)的研究 拮抗細菌在土壤中的定殖能力與防效關系密切，而生防菌的定殖又會對土壤微生物結構群落產生怎樣的影響，值得探討。土壤理化性質