密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 轉(zhuǎn) 植酸酶 基因膠凍樣芽孢桿菌 （ 環(huán)境 安全性及 應(yīng)用效果研究 I 摘 要 鑒 于轉(zhuǎn)基因微生物的潛在環(huán)境安全風(fēng)險，對轉(zhuǎn)基因微生物肥料的生物安全性評價是其應(yīng)用的前提。本文以一株穩(wěn)定高效分泌型轉(zhuǎn)植酸酶基因（ ）工程膠凍樣芽孢桿菌 其野生型 供試菌株，采用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基平板測定法與 態(tài)微板技術(shù)、 16S 析技術(shù)相結(jié)合，對釋放到煙草根際土壤中開展多層次環(huán)境安全性研究 ；同時 對其 進(jìn)行田間應(yīng)用效果 評價 。 煙草小區(qū)試驗表明工程菌處理比對照增加 較出發(fā)菌增產(chǎn) 煙草葉片含 磷量較出發(fā)菌增加 產(chǎn)量和含磷量均達(dá)差異顯著水平；馬鈴薯小區(qū)試驗表明工程菌和出發(fā)菌菌液均能極顯著地增加馬鈴薯塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)，比空白增產(chǎn)達(dá) 但工程菌處理的中大薯的比例較出發(fā)菌提高 30%；工程菌和出發(fā)菌菌液處理的塊莖含磷量分別達(dá)到 95.1 ug/g 和 87.2 ug/g ，工程菌較出發(fā)菌增加 差異達(dá)顯著水平。以上結(jié)果說明外源植酸酶基因（ 工程菌中得到表達(dá)，發(fā)揮了改善作物磷素供給的作用。 用選擇性培養(yǎng)基平板分別計數(shù)煙草根際土壤的細(xì)菌和 接種 菌 的 數(shù)量， 在 2d、 15d、 35d、 57d、93d 取樣 的監(jiān)測結(jié)果表明：在煙草的生長期間，三種處理對根際土壤的細(xì)菌數(shù)量影響不完全一致，以工程菌處理 的細(xì)菌數(shù)量 最多，但差異不顯著， 說明接種 菌種對土壤根際微生物數(shù)量影響甚小 。工程菌和出發(fā)菌在根際土壤中的存活數(shù)量 顯示其在 土壤 中 存活規(guī)律相似，都在 57 天后下降至與對照相當(dāng)水平， 93d 含量已經(jīng)低至難以檢測； 多點監(jiān)測 工程菌在抗性平板、無抗性平板上的數(shù)量差異均不顯著，說明 基因工程菌株穩(wěn)定，無抗性片斷丟失。 態(tài)微板分析技術(shù)的結(jié)果顯示： 接種 工程菌與出發(fā)菌對土壤微生物的代謝活性 均 有明顯的增強作用，工程菌處理的代 謝活性較空白對照和出發(fā)菌分別提高 這 可能是 田間應(yīng)用 基因工程菌 的作物 增產(chǎn) 原因 ；三種處理之間其土壤微生物物種豐富度（ H）和均勻度（ E）整體變化規(guī)律趨于一致，進(jìn)一步的 16S 群結(jié)構(gòu)分析也與之相吻合 。 結(jié)果 說 明轉(zhuǎn)基因工程菌 土壤物種豐富度、均勻度以及區(qū)系結(jié)構(gòu)水平?jīng)]有明顯影響。 本文的研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因工程菌 有效地改善作物的磷素供給，增產(chǎn)效果明顯； 但它 在土壤中不能長期存活， 并不明顯改變 土壤微生物的物種豐富度、均勻度以及區(qū)系結(jié)構(gòu) ，該工程菌的環(huán)境釋放 風(fēng)險較 小。 關(guān)鍵詞： 膠凍樣芽孢桿菌， 植酸酶基因（ ）， 轉(zhuǎn)基因工程菌，環(huán)境安全評價， 態(tài)微 板，變性梯度凝膠電泳 of in of to is a in In of , P . in to 4of as 1. by ) of s 4B1 of s ) g, 2) of s of s P) 2. of on of in in by on 1) in by in 2) 4B1 in by of of is in 7d, of so 3. of on of by 1) as of so on 2) H) E) of of on on s 4. By NA of 6S r to of of on of in on of to 錄 第一章 引言及文獻(xiàn)綜述 . 1 言 . 1 因工程技 術(shù)為生物肥料的發(fā)展提供了有力的技術(shù)支撐 . 1 生物肥料的發(fā)展需要現(xiàn)代生物技術(shù)注入新的活力 . 1 基因工程生物肥料菌種的生物安全研究與評價是其應(yīng)用的前提 . 2 展轉(zhuǎn)基因工程菌株的環(huán)境風(fēng)險評估的重點 . 3 酸鹽菌簡要介紹 . 3 酸鹽細(xì)菌的分類地位 . 3 酸鹽細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特點 . 4 酸鹽細(xì)菌的生理生化特性 . 4 酸鹽細(xì)菌的增產(chǎn)機理 . 5 壤中植酸態(tài)磷的轉(zhuǎn)化及植酸酶基因工程菌的構(gòu)建 . 6 究和應(yīng)用解磷微生物的意義 . 7 酸及植酸酶 . 7 因工程菌的環(huán)境安全性評價 . 8 基因微生物環(huán)境安全評價的必要性 . 8 生物肥料基因工程菌株潛的環(huán)境風(fēng)險 . 8 因工程菌株環(huán)境釋放風(fēng)險評價需考慮的重點 . 9 于基因工程菌的環(huán)境安全評價的方法 . 10 培養(yǎng)技術(shù)檢測方法 . 11 落水平的生理圖譜法 . 12 6S 析方法 . 14 究方法與本文研究目標(biāo)的結(jié)合 . 錯誤 !未定義書簽。 文的研究目的、內(nèi)容和技術(shù)路線 . 15 文的研究目的 . 15 文的研究內(nèi)容和方法 . 15 論研究的總體技術(shù)路線 . 15 第二章 出發(fā)菌及基因工程菌的田間應(yīng)用效果評價 . 16 發(fā)菌及植酸酶工程菌株簡介 . 16 凍樣芽胞桿菌 . 16 酸酶高效分泌型基因工程菌株 . 16 發(fā)菌、基因工程菌的應(yīng)用效果評價 . 17 驗材料 . 17 驗方法 . 19 V 驗結(jié)果與分析 . 20 論與小結(jié) . 22 第三章 出發(fā)菌、基因工程菌在土壤中的存活及對土壤 微生物的影響 . 24 驗材料 . 24 驗方法 . 24 壤取樣 . 24 壤中微生物數(shù)量的測定 . 24 系表面微生物數(shù)量的測定 . 25 標(biāo)菌株在根際的分布測定 . 25 養(yǎng)基平板種類及稀釋倍數(shù) . 25 果與 分析 . 26 草根表可培養(yǎng)微生物總數(shù)的測定結(jié)果 . 26 草根際土壤可培養(yǎng)微生物總數(shù)的測定結(jié)果 . 27 草根表出發(fā)菌硅酸鹽細(xì)菌的存活測定結(jié)果 . 28 草根表工程菌 存活測定結(jié)果 . 28 草根際土壤硅酸鹽細(xì)菌的存活測定結(jié)果 . 29 草根際土壤工程菌 量的測定結(jié)果 . 29 因工程菌株在煙草根際的分布測定 . 30 論與小結(jié) . 31 第四章 根系土壤的 態(tài)微板分析 . 33 驗材料 . 33 試的土壤樣品 . 33 態(tài)微板（ 實驗材料 . 33 驗方法 . 33 態(tài)微板操作方法 . 33 據(jù)分析方法 . 34 果與分析 . 34 供試土壤的 定結(jié)果與分析 . 34 供試土壤的 數(shù)（ H ）測定結(jié)果 . 38 供試土壤微板數(shù)據(jù)的 勻度（ E） . 40 論 . 42 第五章 出發(fā)菌、工程菌處理煙草的根際土壤 析 44 驗材料 . 44 要儀器設(shè)備 . 44 要緩沖液和試劑 : . 44 取試劑 : . 45 驗步驟及方法 . 45 壤樣品的采集 . 45 壤中 提取 . 45 6S 增 . 46 6S 3 區(qū)擴增產(chǎn)物的 泳 . 46 泳結(jié)果的銀染法 . 47 果與分析 . 48 壤樣品總 取 . 48 壤樣品的 16S 3 區(qū)擴增 . 49 壤樣品的 16S 3 擴增產(chǎn)物的 泳結(jié)果 . 50 平膠 泳結(jié)果的相似性分析 . 52 論及小結(jié) . 54 第六章 全文結(jié)論 . 56 參考文獻(xiàn) . 58 致謝 . 62 作者簡歷 . 63 文縮略表 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 基對 性梯度凝膠電泳 氧核糖核酸 磷酸脫氧核糖核酸 化乙錠 二胺四乙 酸 g 千堿基對 m 鐘 米 微克 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 二烷基硫酸鈉 t 醋酸 沖液 VP 乙烯吡咯烷酮 緩沖液 g 克 l 升 （羥甲基）氨基甲烷 物根圈促生細(xì)菌 孔平均顏色變化率 落水平的生 理圖譜 H 數(shù) E 勻度 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué) 位論文 第一章 引言與文獻(xiàn)綜述 1 第一章 引言 及文獻(xiàn)綜述 言 中國是一個農(nóng)業(yè)、人口大國，耕地的不斷減少和人口的持續(xù)增長使我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)越來越承受著巨大的壓力。確保我國農(nóng)業(yè)的高效、可持續(xù)發(fā)展，對我國的經(jīng)濟發(fā)展、國家安全和社會穩(wěn)定，乃至對世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展都具有戰(zhàn)略意義。目前由于全球的化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料使用量的增長，過于依賴 化學(xué)農(nóng)藥和化學(xué)肥料，有機肥使用不足，造成了土壤養(yǎng)分比例失調(diào)，土地板結(jié)，土壤質(zhì)量下降，河流和地下水污染等一系列問題（考恩 瑞金特吉斯等， 1995）。為避免重蹈發(fā)達(dá)國家 先污染，后治理 的覆轍，發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)，就要減少化學(xué)農(nóng)藥和肥料的使用量，尋找其有效的替代品。 微生物肥料作為肥料家族的新成員，是一類以微生物生命活動及其產(chǎn)物導(dǎo)致農(nóng)作物得到特定肥料效應(yīng)的微生物活體制品（葛誠， 1996），具有肥效相對較高、無毒無害、不污染環(huán)境且成本低、可節(jié)約能源等特點，完全符合綠色食品及可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展需要，是化學(xué)肥料的理想輔助 和部分替代品。合理開發(fā)和利用微生物肥料，是保證我國農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一（吳建峰等，2002）。 微生物豐富的生物多樣性及功能多樣性為利用微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮重要作用提供了可能，孕育著巨大的研究和應(yīng)用潛力。微生物肥料作為功能微生物的活體制品，在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農(nóng)作物對硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)藥的吸收，凈化和修復(fù)土壤，降低農(nóng)作物病害發(fā)生，促進(jìn)農(nóng)作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用，保護環(huán)境，以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全等方面表現(xiàn)出了不可替代的作用（李俊等， 2003）。 因工程技術(shù) 為生物肥料的 發(fā)展提供了有力的技術(shù)支撐 生物肥料的發(fā)展需要現(xiàn)代生物技術(shù)注入新的活力 我國目前微生物肥料近年來發(fā)展迅猛，正處于歷史上的最好時期 （李俊等， 2007） ： 1）目前約有 500多家企業(yè)獲得農(nóng)業(yè)部登記，年產(chǎn)量達(dá)到 600萬噸，應(yīng)用面積累計近 1億畝； 2）產(chǎn)品類型多樣，菌劑類和菌肥類共計 11個品種； 3）應(yīng)用菌種種類不斷擴大，涉及細(xì)菌、放線菌、絲狀真菌、酵母菌等 110多個種，而且種類還在不斷增加； 4）應(yīng)用效果已經(jīng)逐漸被社會廣泛認(rèn)可，微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)體系和質(zhì)量意識已經(jīng)深入企業(yè)。 盡管微生物肥料發(fā)展近來發(fā)展迅速， 但與整個肥料行業(yè)發(fā)展規(guī)模相比，所占份額還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，發(fā)展空間巨大。同時，我國微生物肥料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也存在諸如：用菌株相對老化，缺乏高效優(yōu)良生產(chǎn)應(yīng)用菌株；產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，應(yīng)用效果不盡穩(wěn)定等的問題。而微生物肥料產(chǎn)品的應(yīng)用效果中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué) 位論文 第一章 引言與文獻(xiàn)綜述 2 及其前景在很大程度上取決于功能菌株的性能和活體密度，因此選育高性能的功能菌株成為保證微生物肥料產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。在自然菌株選育的基礎(chǔ)上開發(fā)微生物肥料產(chǎn)品已有長久的歷史，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)揮了重要作用。但是，由于自然菌株和傳統(tǒng)技術(shù)本身的一些缺陷與不足，諸如研究周期長、活性低等，農(nóng)業(yè)微生物的產(chǎn)業(yè)化 仍受到很大限制。 近年來，現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展和生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用給農(nóng)業(yè)微生物研究注入了新的活力，特別是基因工程的研究為微生物遺傳改良提供了有效手段，它不僅大大加速了篩選優(yōu)質(zhì)菌種的過程，而且還可以創(chuàng)造符合人們需要的新的優(yōu)良菌種，使農(nóng)業(yè)微生物發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域活躍而創(chuàng)新性的前沿之一（ 2000； 2001）。 在我國 九五 期間，僅農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域分離克隆各類新基因 89個，構(gòu)建高效工程菌株 51株，其中 5 種菌劑經(jīng)安全性評估獲準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗， 6種菌劑進(jìn)入環(huán)境釋放， 5種菌劑完成產(chǎn)品登記或技術(shù) 轉(zhuǎn)讓，部分產(chǎn)品已經(jīng)投產(chǎn)應(yīng)用（黃大昉， 2003）。在 十五 國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（ 863計劃）期間，中國農(nóng)科院、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、南開大學(xué)、中國林科院等多家單位，分離克隆溶磷、農(nóng)藥降解、耐鹽基因多個，構(gòu)建了數(shù)株基因工程菌，菌株性能涉及：溶磷和抑病工程菌，耐鹽、降解苯乙酸，水解甲基對硫磷功能的基因工程菌，降解呋喃丹和甲基對硫磷農(nóng)藥的遺傳穩(wěn)定多功能工程菌，耐鹽和固氮功能的花生、苜蓿根瘤菌工程菌，以及增效苜蓿根瘤基因工程菌。 據(jù)不完全統(tǒng)計，各國獲準(zhǔn)進(jìn)入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工程體環(huán)境釋放總數(shù)的 其中絕大部分的受體微生物為細(xì)菌。目前，中國是世界上農(nóng)業(yè)重組微生物環(huán)境釋放面積最大、種類最多和研究范圍最廣的國家，據(jù)統(tǒng)計，在我國境內(nèi)申報并通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會批準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)重組微生物已超過 40例（林敏， 2002）。 基因工程生物肥料 菌種 的生物安全研究與評價是其應(yīng)用的前提 隨著大量轉(zhuǎn)基因工程菌株的構(gòu)建及出現(xiàn)，工程菌株的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用已經(jīng)成為不可逆轉(zhuǎn)的趨勢。由于生物肥料是活菌制品，一定數(shù)量的活菌體是保證其應(yīng)用效果的基本條件，作為微生物肥料所用的轉(zhuǎn)基因工程菌株必然會大量的釋放在 農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)開放的環(huán)境中；微生物肥料中的工程菌株在施用后，與土壤、水體、空氣、動植物以及人體都有廣泛的接觸，某些菌株甚至可在植物組織內(nèi)定殖而進(jìn)入農(nóng)產(chǎn)品、食品中，因此對微生物肥料所使用的基因工程菌株環(huán)境安全評價尤為重要。 轉(zhuǎn)基因工程菌株是否安全，目前國際上還沒有定論，正面和負(fù)面的報道都有，長期以來都是爭論 的 熱點。在越來越多的轉(zhuǎn)基因生物體向環(huán)境中釋放已經(jīng)成為不可逆轉(zhuǎn)的趨勢時，深入開展轉(zhuǎn)基因工程菌株的微生態(tài)學(xué)研究，不僅可以減少轉(zhuǎn)基因生物環(huán)境釋放中的不確定因素，降低環(huán)境的風(fēng)險性，而且可了解轉(zhuǎn)基因生物釋放后的競爭以及 建立種群的必要條件，幫助轉(zhuǎn)基因工程菌株在環(huán)境中建立種群優(yōu)勢，發(fā)揮其作用。同時，轉(zhuǎn)基因生物安全性和生態(tài)學(xué)的研究對生物技術(shù)的應(yīng)用有重要的推動作用，有助于分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展（張尚通， 1994）。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué) 位論文 第一章 引言與文獻(xiàn)綜述 3 展 轉(zhuǎn)基因工程菌株的環(huán)境風(fēng)險評估 的 重點 工程菌株的環(huán)境監(jiān)控及評價工作主要集中在（林敏， 2002）： 1）監(jiān)測遺傳工程菌在環(huán)境中的生存、種群建立、在植物根系定殖的能力以及重組 2）監(jiān)測遺傳工程菌釋放后對環(huán)境的潛在沖擊，主要指環(huán)境微生物群體結(jié)構(gòu)的變化和代謝類型的變化。 一些 國際 著名 的 實驗室將近年來興起的免培養(yǎng)分子技術(shù)，包括 單一碳源底物利用的 16S 分子水平和群體代謝水平揭示 人類活動 對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性的影響和沖擊效應(yīng) （ 2004） 。 酸鹽 菌 簡要介紹 硅酸鹽細(xì)菌，俗稱 鉀細(xì)菌 ，最初分離自蚯蚓腸中，是一類可分解正長石等硅酸鹽礦物和磷灰石的芽胞桿菌。 1930年，原蘇聯(lián)學(xué)者 現(xiàn)這是土壤中一類 能分解硅酸鹽類礦物并釋放出磷、鉀等元素供植物利用的細(xì)菌，同時亦有固氮功能（李元芳，1994）。這類細(xì)菌在土壤中能通過自身生命活動， 已經(jīng)在多個方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用性能，如：分解硅鋁酸鹽類及無機磷礦物，釋放鉀、磷營養(yǎng)元素，產(chǎn)生植物生長激素、有機酸和氨基酸類物質(zhì)，改善植物營養(yǎng)及生長條件（曹鳳明等， 2004），同時產(chǎn)生的胞外多糖具有增強植物非特異性免疫能力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用效果。 該 類 菌種是 我國 近年來生物肥料產(chǎn)業(yè)應(yīng)用最為廣泛的菌株，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)有著四十多年的應(yīng)用歷史， 在微生物肥料產(chǎn)業(yè)界有著良好的 應(yīng)用表現(xiàn)。據(jù)不完全統(tǒng)計，該類菌種在我國生物肥料行業(yè)中 25%以上的企業(yè)采用過該菌種作物生產(chǎn)菌種使用，在生物肥料行業(yè)中影響巨大，一直是微生物肥料研究和應(yīng)用的熱點。 此外 ，該類菌種 在采礦、冶金、飼料工業(yè)領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用 。 酸鹽細(xì)菌的分類地位 硅酸鹽細(xì)菌的分類地位目前仍沒有完全確信的歸屬，較為認(rèn)同的觀點是 硅酸鹽細(xì)菌 并不是某個特定種屬的特指，而是 具有分解硅鋁酸鹽類及無機磷礦物，釋放鉀、磷營養(yǎng)元素功能 一大類細(xì)菌的總稱，因此不是隸屬于單一種，而是屬于于幾個較為近緣的種 。 1911年 921年研究結(jié)果將這類細(xì)菌定為 1939年原蘇聯(lián)學(xué)者 接從土壤中分離到一種細(xì)菌，能分解正長石和磷灰石而釋放出磷鉀，稱之為硅酸鹽細(xì)菌 (亞歷山羅夫， 1955)，后來命名為 1940 年波蘭學(xué)者 從土壤中分離一種新的可產(chǎn)生明膠狀物質(zhì)的有機體， 指出這種有機體最為顯著的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué) 位論文 第一章 引言與文獻(xiàn)綜述 4 特征是可在不同的碳水化合物培養(yǎng)基中形成一層厚的、明膠狀的莢膜，并對這種有機體的莢膜性質(zhì)及成分作了比較系統(tǒng)的研究，把這種有機體稱之為 健等， 2000）；陳庭偉等發(fā)現(xiàn)，硅酸鹽細(xì)菌在我國分布很廣，各地土壤中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)且分離菌株的形態(tài)差異不大，皆為大莢膜桿菌，產(chǎn)芽胞，革蘭氏染色陰性，在無氮的培養(yǎng)基上菌落呈半玻璃珠狀光亮突起，與述的形態(tài)、生理特征十分相似（陳庭偉， 1960）。 0年代其開始對一株硅酸鹽細(xì)菌的生長 理形狀及其 +定， 6S 1998在國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志 壤芽胞桿菌）， 為模式菌株； 1480D 作為 質(zhì)芽胞桿菌）的模式菌株（ 1986； 997），國際細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)雜志 1998年收錄并承認(rèn)了這兩個新種和各自的模式菌株；何琳燕等對南京地區(qū)黃棕壤中分離的一株硅酸鹽細(xì)菌 果表明該菌與膠質(zhì)芽孢桿菌（ 土壤芽孢桿菌（ 緣關(guān)系最近，并將其確定為土壤芽孢桿菌的一個亞種（何琳燕， 2001）。 另外，有學(xué)者則提議將硅酸鹽細(xì)菌歸為環(huán)狀芽孢桿菌（ （ 984；李鳳汀 ,1997）；劉光燁等從紫色土壤中分離篩選出具有釋鉀、拮抗雙重活性的硅酸鹽細(xì)菌 株，并鑒定為多粘芽胞桿菌（ B. 劉光燁， 2002）；賀積強等從四川各地分離到大量的硅酸鹽細(xì)菌菌株，經(jīng)分類鑒定分別命名為巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽胞桿菌，但上述不同菌種的形態(tài)并不一致，而且都稱為硅酸鹽細(xì)菌（賀積強， 1999）。 綜上所述，盡管硅酸鹽細(xì)菌的多樣性普遍存在。但綜合其形態(tài)、生理特征，具有數(shù)層厚的、明膠狀的大莢膜，革蘭氏染色不定，在無氮的培養(yǎng)基上菌落呈半玻璃珠狀光亮突起等特點來看，這類產(chǎn)芽孢桿菌與膠質(zhì)芽孢桿菌（ 土壤芽孢桿菌（ 緣關(guān)系最近，國內(nèi)目前微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用所使用的硅酸鹽細(xì)菌都應(yīng)在這個類群之中。 酸鹽細(xì)菌的形態(tài)學(xué) 特點 養(yǎng)體形態(tài) 細(xì)胞粗長桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色反應(yīng)不定，產(chǎn)生聚 粒；在無氮培養(yǎng)基上菌體大小為（ 個菌體或多個菌體包裹在同一莢膜邊界內(nèi)形成菌膠團，外被肥厚夾膜，并呈現(xiàn) 2時比菌體大 10倍以上；芽孢壁厚，橢圓形，中生或偏端生，芽孢囊微膨大（曹鳳明 ， 2004；何琳燕 ， 2001）。 落形態(tài) 在無氮的阿須貝瓊脂培養(yǎng)基上菌落膠質(zhì)粘稠、濕潤，形成光亮透明、邊緣整齊圓形隆起菌落，挑起時富有彈性，可拉成絲。通常在 28 培養(yǎng) 48小時，菌落直徑可達(dá) 3庭偉， 1960）。 酸鹽細(xì)菌的 生理生化特性 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué) 位論文 第一章 引言與文獻(xiàn)綜述 5 目前對硅酸鹽細(xì)菌生理生化特性研究的文獻(xiàn)報道相對較少：好氧或兼性厭氧生長，水解淀粉、硝酸鹽還原、接觸酶反應(yīng)陽性； V. 檬酸鹽利用、氧化酶和卵磷脂酶反應(yīng)陰性；可使牛奶陳化，使石蕊褪色等特征。最適生長溫度 25 35 ，最適 何琳燕， 2001； 連賓 ， 2002）。 酸鹽細(xì)菌的增產(chǎn)機理 鉀效果及解鉀機理 長期以來，硅酸鹽細(xì)菌在我國生物肥料界都被作為能改善作物鉀素營養(yǎng)的生物肥料菌種使用，解鉀效果及機理也一直是研究的重點和熱點。自上世紀(jì) 60年代，陳廷偉等都曾對硅酸鹽細(xì)菌的形態(tài)生理及其對磷鉀礦物的分解能力作了較為全面的研究 （ 陳廷偉 ， 1960） ，在以長石、云母及土壤礦物為鉀該類源的培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，硅酸鹽細(xì)菌對不同類型礦粉的釋鉀能力不同，該類細(xì)菌接到土壤后長期培養(yǎng)，雖然其增加量不穩(wěn)定，可增 加土壤中的速效鉀。池景良等分離出的硅酸鹽細(xì)菌在純培養(yǎng)條件下，用鉀長石為底物釋鉀量可達(dá) 在無作物的情況下在草甸棕壤土中速效鉀可提高 山地棕壤土中速效鉀可提高 池景良， 1999）；盛下放等通過搖瓶和土柱試驗對硅酸鹽細(xì)菌 瓶試驗表明接活菌比對照的鉀含量增加 土柱試驗表明該菌在黃棕壤和水稻土中均能存活并表現(xiàn)一定的釋鉀作用 （ 盛下放 ， 2000） 。國外學(xué)者 果也表明硅酸鹽細(xì)菌 在土壤生物風(fēng)化中起了顯著作用（ 1984）；徐鳳花等將硅酸鹽菌劑與土壤混合制成每克干土含 10 億左右細(xì)胞的生物鉀肥，用于大豆試驗，結(jié)果表明可使土壤中有效氮磷鉀含量提高，促進(jìn)大豆植株對養(yǎng)分的吸收，使其干物質(zhì)積累量增加，根瘤數(shù)量提高（徐鳳花， 2000）。王思遠(yuǎn)等研究了硅酸鹽細(xì)菌與化肥配施對烤煙和土壤的綜合效應(yīng)，結(jié)果表明硅酸鹽細(xì)菌能明顯地促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)煙草植株對養(yǎng)分的吸收利用和生長發(fā)育，配合一定量的氮、磷、鉀化肥施用效果更好。氮、磷、鉀的轉(zhuǎn)化效果分別比對照高 并能明顯地促進(jìn)煙株的生長發(fā)育（王思遠(yuǎn)， 2002）。 在硅酸鹽細(xì)菌解鉀機理認(rèn)識 方面 ，目前國內(nèi)外學(xué)者見解不同，主要集中在酸解、酶解、莢膜胞外多糖形成、細(xì)菌 歷山大羅夫認(rèn)為，硅酸鹽細(xì)菌產(chǎn)酸是使礦物中不溶性鉀釋放的主要機制（亞歷山羅夫， 1955），但陳廷偉、陳華癸等持不同的觀點，他們認(rèn)為硅酸鹽細(xì)菌在培養(yǎng)過程中并不產(chǎn)生明顯的酸，該細(xì)菌為大莢膜芽孢桿菌，它可能是利用本身特有的粘厚的大莢膜包被礦石并與其緊密接觸，產(chǎn)生特殊的酶破壞礦石晶體構(gòu)造釋放出其中養(yǎng)分，或是 通過表面的物理化學(xué)接觸交換作用而將有效鉀釋放出來（陳廷偉， 1960）。盛下放等人發(fā)現(xiàn)所分離到的 酸鹽細(xì)菌株能合成并分泌草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等和多種氨基酸到發(fā)酵液中，他們認(rèn)為 株的釋鉀作用與其代謝產(chǎn)物有關(guān)，它們能破壞鉀長石礦物晶格結(jié)構(gòu)，主要是通過有機酸、氨基酸的酸溶以及有機酸、氨基酸和莢膜多糖的絡(luò)和作用共同實現(xiàn)的