蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 871 第一章 前言 惡性膠質(zhì)瘤（ 腦內(nèi)最常見的惡性腫瘤，屬于神經(jīng)上皮腫瘤，其發(fā)生率在腦腫瘤發(fā)病中占 40具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高、生存質(zhì)量差、治療難度大等特點(diǎn)。其治療一直是困擾神經(jīng)外科醫(yī)生的難題，如何找到切實(shí)有效可行的治療手段，一直是廣大神經(jīng)外科醫(yī)生研究的方向之一。目前治療主要以手術(shù)治療為主，配合放療、化療及生物醫(yī)學(xué)治療等手段，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生存率仍不能達(dá)到兩年 1 自上世紀(jì) 70 年代以來，科學(xué)家經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在臍帶基質(zhì)（間充質(zhì)）中以及哺乳類動(dòng)物骨髓基質(zhì)中存在具有能分化形成骨、脂肪、軟骨以及神經(jīng)等細(xì)胞能力的多分化潛能的細(xì)胞亞群，將其稱為間充質(zhì)干細(xì)胞 （ 4。研究發(fā)現(xiàn)在臍帶基質(zhì)中不但存在具有多向分化潛能的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（ 還存在在大量的血細(xì)胞、單核細(xì)胞及造血干細(xì)胞 5。研究發(fā)現(xiàn) 不具有排斥性，倫理問題也較少，越來越多的受到科研工作者的關(guān)注，已研究應(yīng)用于許多功 能缺陷型疾病、器官組織退行性病變、遺傳性疾病以及某些惡性腫瘤的診斷治療當(dāng)中，還應(yīng)用于某些基因工程及組織工程領(lǐng)域的研究 6，但其對(duì)惡性腫瘤是抑制、促進(jìn)還是向正常組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化目前還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，對(duì)惡性腫瘤的治療研究還未應(yīng)用于臨床。 通過大量的體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞為理想的生物治療手段，已有相關(guān)報(bào)道證實(shí)間充質(zhì) 干細(xì)胞能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化 7。細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)方面的大量研究已近對(duì)共培養(yǎng)可能的機(jī)制進(jìn)行了大量研究探討 8，研究證實(shí)體外干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)有以下機(jī)制：（ 1） 活蛋白激酶而作用于相應(yīng)受體的的旁分泌機(jī)制；（ 2）細(xì)胞 9；（ 3）縫隙連接機(jī)制，縫隙連接是干細(xì)胞增殖分化過程中必須的機(jī)制或過程。 本實(shí)驗(yàn)通過 外培養(yǎng)及鑒定方法建立的基礎(chǔ)上，研究探討 究探討 惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 系 （ 直接或間接共培養(yǎng)可能產(chǎn)生的結(jié)果，觀察 胞形態(tài)、細(xì)胞周期及超微結(jié)構(gòu)改變等的影響，分析 胞生物學(xué)行為的影響作用，總結(jié) 培養(yǎng)方法 與經(jīng)驗(yàn) 。 為進(jìn)一步研究提 供方法和基礎(chǔ)。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 872 第二章 材料與方法 驗(yàn)材料 足月健康新生兒臍帶一根 （肝炎系列、 傳染指標(biāo)均為陰性） ，由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院產(chǎn)科提供。 人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 主要試驗(yàn)儀器 磨砂載玻片 （ 江蘇海門 ） 恒溫烤箱 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 ) 光學(xué)顯微鏡 （日本 司 ） 恒溫水浴箱 (江蘇儀器廠 ) 滅菌鍋 （上海） 移液器 （美國 ） 熒光定量 (加拿大 ) 微波爐 （美 國 ，中國） 4冰箱 （海爾，中 國） 溫冰箱 （ 國） 物顯微鏡 （ 本） 增儀 司 胞培養(yǎng)箱 置相差顯微鏡 ( 外分光光度計(jì) 式高速冷凍離心機(jī) 式細(xì)胞儀（ 國 養(yǎng)版 主要試劑 養(yǎng)基 （ 美國 司 ） 胎牛血清 （ 杭州四季青生物工程研究所 ） 重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 北京雙鹿藥業(yè) (逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (連寶生物公司 ) 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 873 I 凋亡試劑盒 司 胰蛋白酶 美國 司 熒光定量 （ 司） 兔抗小鼠 （ 兔抗小鼠 （ 磷酸鹽緩沖液 (司，美國 ) (美國 氯仿 (上海化學(xué)試劑公司 ) 異丙醇 (上?；瘜W(xué)試劑公司 ) 無水乙醇 (上海化學(xué)試劑公司 ) (大連寶生物 ) 熒光定量 劑 (大連寶生物 ) (大連寶生物 ) (大連寶生物 ) 物公司 物公司 物公司 記山羊抗兔 蘭州博研生物有限公司 蘇木子 北京中杉金橋生物技術(shù)公司 臺(tái)盼蘭 上?；瘜W(xué)試劑分裝廠 司，美國，上海化學(xué)試劑廠分裝 司，美國上海化學(xué)試劑廠分裝 司，美國 ,上海化學(xué)試劑廠分裝 液的配制 按 標(biāo) 準(zhǔn) 配 方 配 置 的 稱 取 2 將上述試劑依次溶解于 800 攪拌 ，使試劑充分溶解 ，調(diào)節(jié) 至 補(bǔ)加 1000勻 ， 將其分裝入鹽水瓶中，10鐘高壓蒸汽滅菌， 4冰箱內(nèi) 保存 備用。 用水配置 液， 分裝備用。 用無菌 液調(diào)節(jié) 至 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 874 胞培養(yǎng)液的配制 拆開包裝后，將干粉型培養(yǎng)基溶于欲配置液體 800，沖洗包裝袋兩次倒入培養(yǎng)液中，加入磁性攪拌棒置于磁性攪拌器上充分?jǐn)嚢?，確保培養(yǎng)基干粉充分溶解； 倒入 1L 容量瓶中，加入 加入抗生素：按青霉素 100u/霉素 100ug/ 按 10%加入經(jīng) 56滅活的胎牛血清，補(bǔ)加 近 1000 調(diào)節(jié) 至 用 m 和 膜 各一張，高壓蒸汽滅菌后，將上述溶液加入濾器過濾除菌； 將過濾除菌后的培養(yǎng)液分裝于貼有標(biāo)簽的無菌儲(chǔ)液瓶中，加蓋，封口膜加封瓶口， 保存 于 4冰箱內(nèi)備用。 胰蛋白酶消化液的配制 稱取 1： 125 的胰蛋白酶粉末 加入 100 磁力攪拌器攪拌混勻，使之完全溶解； 加入 20上述溶液； 過濾除菌，分裝保存于 4冰箱內(nèi)備用 。 碘化丙啶（ 配制 稱取 櫞酸鈉 加 100 保存于 4冰箱內(nèi)備用 。 離、培養(yǎng)與鑒定 離、培養(yǎng) （ 1） 高溫高壓消毒手術(shù)器械及玻璃器皿，操作遵循手術(shù)無菌操作原則。 （ 2） 取足月健康新生兒臍帶一根，洗凈后浸泡于 25u/素鈉，100u/100mg/霉素）中 2時(shí)。 （ 3） 超凈臺(tái)內(nèi)取出臍帶，將其切成 2除動(dòng)脈、靜脈及外膜，在將其剪成大小約 于加有 10%胎牛血清的 養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中， 部分加入含 10%胎牛血清（ ,終濃度為 20ug/ 養(yǎng)基， 將其 平 置于 370C、 5%全濕條件培養(yǎng)箱中 進(jìn)行組織塊貼壁培養(yǎng) 。 培養(yǎng)瓶蓋在旋緊后再旋松一周，使 夠進(jìn)入培養(yǎng)瓶，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 （ 4） 培養(yǎng) 7 天左右，細(xì)胞自組織塊周圍逐漸爬出，每隔 72時(shí)全量 含蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 875 10% 濃度為 20ug/l 養(yǎng)基 全量 換液一次， 每次換液用 5沖洗培養(yǎng)瓶底細(xì)胞層 3遍，棄去廢液；每隔 48眼觀察培養(yǎng)基由紅轉(zhuǎn)黃后進(jìn)行全量換液。 （ 5） 待細(xì)胞變形生長(zhǎng)大 70右時(shí)，用 蛋白酶 /于370C、 5%養(yǎng)箱 消化 1倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞胞體回縮變圓，貼壁細(xì)胞脫落后， 加胎牛血清終止消化過程 ， 加培養(yǎng)基小心吹打，待細(xì)胞自管壁完全脫落 。 （ 6） 將 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) 細(xì)胞懸液移 至無菌 離心管內(nèi) 1200 轉(zhuǎn) /心 5 分鐘，棄去上清， 載加入生理鹽水或 分棄去細(xì)胞碎片及死亡細(xì)胞。 （ 7） 加入 1細(xì)胞吹打混勻后 ，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，依據(jù)細(xì)胞數(shù)量 以1:2 比例傳代培養(yǎng)，標(biāo)記為 同樣方法將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至 式細(xì)胞儀鑒定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 定 （ 1）將 懸 ， 使細(xì)胞分散， 用 進(jìn)行沖洗； （ 2） 將單細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，棄去上清，重新懸浮于 50C 預(yù)冷的鹽水中 ； （ 3） 緩慢加入 5%乙醇 15其終濃度為 70%，冰浴30 40 （ 4）將固定后的細(xì)胞加入 5懸，將其配成 1 （ 5）將等體積的細(xì)胞懸液與 液混合， 400 （ 6）將樣品用 300目尼龍膜過濾。 （ 7）將樣品加入 美國 司生產(chǎn)的（ 樣品室，以激發(fā)波長(zhǎng) 488定，用 V 分析軟件對(duì) 胞周期進(jìn)行分析，檢測(cè)前用標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整 在 2%以內(nèi)。 87養(yǎng) (1) 胞由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心魏虎來教授饋贈(zèng)。 (2)將凍存于液氮中的 的細(xì)胞用 37攝氏度溫水復(fù)蘇后，將其移于加有 2倍于細(xì)胞凍存液的 養(yǎng)基的離心管中， 1200轉(zhuǎn) /分離心 5分鐘棄去上清，防止細(xì)胞凍存液中的 細(xì)胞貼壁造成影響。 用生理鹽水或 其進(jìn)行沖洗再離心，棄去廢液，加入 10% 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù) 。 (3)按細(xì)胞數(shù)量按比例 接種于含 10%胎牛血清的 養(yǎng)液中， 將培養(yǎng)瓶平 置于 370C、 5% (4)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 876 培養(yǎng)體系建立 清液 與 培養(yǎng) （ 1） 收集 清液 ： 4 代細(xì)胞傳代培養(yǎng)。 （ 2） 待 滿培養(yǎng)瓶壁 80%時(shí)，用 10%量換液，繼續(xù)培養(yǎng) 72小時(shí)后，收集其上清，將其用 10% 原液、 1:2、 1:4及 1:8稀釋備用。 （ 3）解凍復(fù)蘇 種于培養(yǎng)瓶中，用 10% 370C、5% （ 4）待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁后，用胰蛋白酶消化發(fā)將細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù) 其稀釋呈濃度為 1l 的濃度，分別以 1接種于 24孔板。 （ 5）加入 10%養(yǎng) 72小時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板 80%，棄去上清，用 （ 6）分別在各孔中以原液、 1:2、 1:4 及 1:8加入收集制備的 每組設(shè) 4個(gè)附孔，并以 （ 7）分別在 24小時(shí)、 36小時(shí)、 48小時(shí)、 60小時(shí)及 72小時(shí)取出培養(yǎng)板、收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 胞直接 共培養(yǎng)體系建立 （ 1）將培養(yǎng)備用的 光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入含 10%濃度調(diào)整為 1直接共培養(yǎng)工作液。 (2)將上述工作液以每孔 1量加入 24孔板，加蓋 置于 370C、 5%全濕條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng) ，并觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。 （ 3）培養(yǎng) 24 小時(shí)后，棄去 24孔板中原培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)版底部細(xì)胞層，將松散細(xì)胞及細(xì)胞碎片清除，純化細(xì)胞體系。 （ 4） 將鋪滿培養(yǎng)瓶底的 000r/心 5棄上清液，細(xì)胞用 1懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 將 （ 5）將制備的 胞 懸液以 每孔 1 24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，并定期觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。 （ 6）分別在第 3天和第 7天取出培養(yǎng)板，分別收集共培養(yǎng)后每孔的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)液將培養(yǎng)板每孔沖洗干凈。 （ 7）將每孔中收集的 胞以 1000r/心 5式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。 層培養(yǎng)體系建立 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 877 （ 1）將培養(yǎng)備用的 成單細(xì)胞懸液，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入含 10%將濃度調(diào)整為 1 (2)將上述工作液 以每孔 14孔 養(yǎng)板上室，加蓋 置于 370C、 5%并觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。 （ 3） 將鋪滿培養(yǎng)瓶底的 胞吹打脫壁后 1000r/心 5棄上清液，細(xì)胞用 1懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 將 細(xì)胞懸液 。 （ 4）將制備的 液以每孔 14孔 養(yǎng)板下室進(jìn)行培養(yǎng)，并定期觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。保證上下兩室工作液通過小室底膜互相接觸。 （ 5）將 胞單 純培養(yǎng)與 24孔板中做陰性對(duì)照。 （ 6）將 養(yǎng)板置于 370C、 5%全濕條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 間接共培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中不進(jìn)行常規(guī)換液，定期觀察上下兩室細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)改變。 （ 7）分別在第 3天和第 7天取出培養(yǎng)板，分別收集共培養(yǎng)后每孔的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)液將培養(yǎng)板每孔沖洗干凈。 （ 8）將每孔中收集的 胞以 1000r/式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。 （ 9）另送共培養(yǎng)前后細(xì)胞至蘭州大學(xué)繼續(xù)醫(yī)學(xué)院電鏡室進(jìn)行透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。 檢測(cè) 養(yǎng)上清液對(duì) 胞 增殖的影響 (1) 在共培養(yǎng)各組， 按 預(yù)定計(jì)劃 設(shè) 12h、 24h、 36h、 48h、 60h 及 72h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn) 。在各時(shí)間點(diǎn) 分別在每孔加 5mg/20l， 37 繼續(xù)孵育 4小時(shí)，使 止培養(yǎng)并吸棄上清液； 每孔加 150微升 色， 37 至少靜置 30 至過液 )，使甲質(zhì)顆粒充分溶解，在酶標(biāo)儀以檢測(cè)波長(zhǎng) 490 取 。 (2) 以時(shí)間為橫、光吸收值（ A）為縱坐標(biāo)繪制正常 10%養(yǎng)條件下及不同濃度 用下 胞生長(zhǎng)曲線。 (3) 計(jì)算不同濃度、不同時(shí)間段 胞的抑制率。計(jì)算公式為：抑制率 =（ 1D 值 /對(duì)照組平均 ） 87胞與 培養(yǎng)后 細(xì)胞形態(tài)變化 觀察 （ 1）分別 將正常培養(yǎng)、以及 培養(yǎng)細(xì)胞 72h，在熒光倒置顯微鏡下 觀察 胞 及 共培養(yǎng)前后細(xì)胞形態(tài) 學(xué)變化。 （ 2） 用 培養(yǎng)組細(xì)胞， 觀察 胞 及 胞形蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 878 態(tài) 變化 。 （ 3）照相留用。 式細(xì)胞儀檢測(cè) 胞與 培養(yǎng)前后 胞細(xì)胞周期 變化 （ 1） 收集正常 10%87胞、與 培養(yǎng)后 清液 處理后 胞 。 （ 2） 用 滌細(xì)胞 2 次。 （ 3） 用 離心后的細(xì)胞沉淀 重懸成單細(xì)胞懸液 。 （ 4） 緩慢加入 4 無水乙醇，吹散混勻，使乙醇終濃度達(dá) 70%， 密封 4 固定 24h。 （ 5） 1000r/心 5， 棄 去 乙醇， 滌細(xì)胞 2 次 ， 100l 次 懸浮細(xì)胞 。 （ 6）在單細(xì)胞混懸液中 加 色液 300l，作用 15 （ 7） 流式細(xì)胞儀測(cè)定 量的變化，分析 細(xì)胞周期 變化 。 胞細(xì)胞 色 （ 1） 取普通潔凈蓋玻片 數(shù)張，置 于 70%乙醇中 浸泡 5立于 無菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干， 高壓蒸汽滅菌。 （ 2） 將蓋玻片置于 24孔板內(nèi)，種入 置于 37 、 5%養(yǎng) 24小時(shí)，棄去培養(yǎng)液。 （ 3）用 1:2、 1:4和 1:8不同濃度 同時(shí)間后，吸 棄 培養(yǎng)液 。 （ 4） 加入 聚甲醛 定 30 （ 5） 吸 棄 固定液，用 次 ，吸盡液體。 （ 6） 加入 色液，染色 5滴加抗熒光淬滅液于載玻片上 ， 用蓋玻片封片 ， 盡量避免氣泡，使細(xì)胞接觸封片液 。 (7) 熒光顯微鏡 下以 激發(fā)波長(zhǎng) 350發(fā)射波長(zhǎng) 460檢測(cè)到呈 綠色的細(xì)胞核。并照相備用。 共培養(yǎng)前后 （ 1）取普通潔凈蓋玻片數(shù)張， 泡酸過夜 ,超聲波超聲清洗至少 2個(gè)小時(shí)。 （ 2）泡飽和的碳酸氫鈉溶液過夜。清洗后泡酒精中，備用。 （ 3）實(shí)驗(yàn)前將蓋玻片從酒精中取出，立于超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干，高壓滅菌備用。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 879 （ 4）在超凈臺(tái)中，打開滅菌完全的飯盒，取出蓋玻片， 放入無菌六孔板中 （ 5）將胰酶消化后的單細(xì)胞懸液，調(diào)整成 1 106個(gè) /種到六孔板中。 （ 6）待細(xì)胞長(zhǎng)滿 80%左右時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 （ 7）將六孔板中培養(yǎng)基吸干，預(yù)冷的 洗 3次。 （ 8）加入 10%甲醛，固定至細(xì)胞發(fā)白， 次，每次 3分鐘。 （ 9）加入 37 15 分鐘（細(xì)胞膜打孔，以便于讓抗體進(jìn)入）， 次，每次 3分鐘 （ 10）加入 3% 過氧化氫，室溫 15 分鐘（目的是滅活內(nèi)源性的 次，每次 5 分鐘，防止殘余的雙氧水滅活二抗上標(biāo)記的 （ 11）分別加入適當(dāng)濃度的 上六孔板的蓋子， 4度冰箱，過夜。 （ 12）次日， 37 度水浴復(fù)溫 1小時(shí)， 洗 3次，每次 5分鐘。 （ 13）加入適當(dāng)濃度的二抗，蓋上六孔板的蓋子， 37 40鐘， 洗 3次，每次 5分鐘。 （ 14） 色，蘇木素襯染。 （ 15）脫水，透明，封片，鏡檢后照相留用。 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用 件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生長(zhǎng)曲線應(yīng)用 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8710 第三章 結(jié)果 分離、純化和鑒定 培養(yǎng)過程中形態(tài)學(xué)變化 臍帶常規(guī)進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，常規(guī) 10%液、傳代。 將 胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，吹打至細(xì)胞完全脫落，將細(xì)胞懸液一紙離心管中以 1000r/心 5行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以 1細(xì)胞濃度用10%7、 5%胞于 1248全貼壁，培養(yǎng)液由紅轉(zhuǎn)黃，進(jìn)行全量換液。 72 小時(shí)后見細(xì)胞呈巢狀生長(zhǎng)，細(xì)胞成梭形或多角形，以長(zhǎng)梭形為主，形狀大小各異。96h 120胞增殖加速，生長(zhǎng)方向一致，逐漸融合鋪滿瓶底，細(xì)胞增殖開始減慢，細(xì)胞變得寬大扁平，細(xì)胞老化，出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象（見圖 1）。 圖 1 A 圖為 12h 形態(tài)變化； B 圖為 24h 形態(tài)變化； C 圖為 36D 圖為 48h 形態(tài)變化； E 圖為 72h 形態(tài)變化； F 圖為 6h 形態(tài)變化 at ： 2h B: 4h C : 6h D: 8h E : 2h F: 6h 疫 表型鑒定 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8711 流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代后 性對(duì)照在 ， ， ， ，圖 2) 圖 2 （ 不同濃度 清液作用下生長(zhǎng)曲線及抑制率 抑制作用， 96小時(shí)培養(yǎng)后 1:8、1:4、 1:2及未稀釋的 清液對(duì) 7%， 24%， 且具有時(shí)間、濃度依賴性，與對(duì)照組（ 胞與 常培養(yǎng)組） 兩者之間比較有顯著差異。 *P*PS 州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8712 圖 3 87MG by 色法結(jié)果顯示 抑制作用， 96小時(shí)培養(yǎng)后 1:8、1:4、 1:2及未稀釋的 清液對(duì) 抑制率分別為 17%， 24%， 且具有時(shí)間、濃度依賴性，與對(duì)照組（ 胞與 常培養(yǎng)組） 兩者之間比較有顯著差異。 共培養(yǎng)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 胞形態(tài) 在正常應(yīng)用 8小時(shí)后在倒置 瑞士染色后 觀察 細(xì)胞清晰呈多角形，呈巢狀生長(zhǎng)（附圖 4A）；在加入 養(yǎng) 48小時(shí)后，細(xì)胞骨架消失 , 融合成片，部分細(xì)胞脫落，胞體收縮變形 （ 附圖 4B）。 圖 4 （ 887） 87MG in A 8h 87MG ） 共培養(yǎng)前后 2次 養(yǎng)瓶底部細(xì)胞伸展變形，成多角形或梭形，折光性好，細(xì)胞核較大（ A）。細(xì)胞經(jīng)過繼續(xù)換液培養(yǎng)2周左右單細(xì)胞層逐漸成巢狀分布，將細(xì)胞消化傳代繼續(xù)培養(yǎng) 12小時(shí)，細(xì)胞逐漸由圓形變?yōu)樗笮位蚨嘟切?，切形態(tài)規(guī)則，折光性強(qiáng)（ B）；繼續(xù)培養(yǎng)檢細(xì)胞增至明顯加快， 720%左右（ C）。將 874 下可見 起消失，局部呈鋪路石樣增殖（ D）。（見圖 5） 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8713 圖 5 (A 次換液后形態(tài)變化； B 培養(yǎng) 15天傳代后 12小時(shí)形態(tài)變化； C 傳代后 4D 87) (A B 2 5 C -5 D 87MG 4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：在 濃度為 1/2和 1/4 時(shí)分別作用12h、 24h 和 48h 后， 定細(xì)胞周期結(jié)果顯示（圖 4）：用 1/2 清液培養(yǎng) 2h 后出現(xiàn)亞二倍體峰（ 占細(xì)胞總數(shù)的 用 87胞 48h 后，出現(xiàn)明顯亞二倍體峰（ 占細(xì)胞總數(shù)的 在 1/2 2h 后 即 可使 期阻滯，87出現(xiàn)了周期阻滯現(xiàn)象（主要為 (%) 87 %) ) *P*PS 胞 細(xì)胞 色 細(xì)胞 色 是可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料， 染色后細(xì)胞呈綠色，其具有低毒性，不對(duì)細(xì)胞造成損害， 色常用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡， 胞經(jīng) 染色 后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn) 正常 培養(yǎng)的 胞核受紫外光激發(fā) ， 發(fā)射出 鮮明 的 綠 色熒光 ， 活細(xì)胞呈彌散均勻熒光 ,核質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰 ； 培養(yǎng) 作用 24 胞 形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)，其 細(xì)胞皺縮 ， 出泡 ， 染色質(zhì)濃縮 ， 核碎裂 (圖 7)。 在熒光顯微鏡下觀察， 胞經(jīng) 色 的細(xì)胞核，以及光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化，有如下變化特點(diǎn)：隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和 清液 濃度梯度的增加，經(jīng) 清液 處理組的細(xì)胞逐漸顯示出典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征， 細(xì)胞胞體皺縮，呈圓球形，細(xì)胞核呈濃染的碎塊狀， 24h 更加明顯 。 圖 7 (200) 87胞經(jīng) B： 胞與 清液 1： 4作用后經(jīng) C： 胞與 清液 1： 2作用后經(jīng) D： 胞與 清液原液作用后經(jīng) 色細(xì)胞核形態(tài)變化； 200) A : 87MG B: 州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8715 :4 of C: 87MG :2 of 共培養(yǎng)前后 疫組化檢測(cè)結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色，培養(yǎng) 1小時(shí)后 24h 后 9）。 圖 9 共培養(yǎng)后 疫組化檢測(cè)變化 (州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8716 第四章 討論 腫瘤是一種多基因、 多步驟突變的進(jìn)化性疾病，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、分化受阻在大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中居重要地位 10。臨床多種治療手段均有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并可阻滯腫瘤細(xì)胞某一細(xì)胞周期而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，但目前常用的放射治療以及化學(xué)治療均為姑息性治療手段 11。故研究新的治療手段對(duì)控制腫瘤具有重要意義。 腦惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性腫瘤，其具有治療效果差，復(fù)發(fā)率高、死亡率高等特點(diǎn) 12。手術(shù)治療聯(lián)合化療、放療和生物治療后 3年 13, 14。對(duì)于腦惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的新的輔助治療，尤其是干細(xì)胞的研究是近年來的研究熱點(diǎn)。 目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。 所有的腫瘤組織并不是由單純、均一的腫瘤細(xì)胞所組成的，在腫瘤組織中不同的細(xì)胞具有不同的增殖、分化、浸潤和轉(zhuǎn)移能力，亦即腫瘤的異質(zhì)性。其中存在少數(shù)擔(dān)當(dāng)著干細(xì)胞角色的腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞的基 本特性：包括自我更新能力、無限的增殖能力和多向分化潛能，近年來被學(xué)者稱之為腫瘤干細(xì)胞 （ 。在神經(jīng)系統(tǒng)中，有很強(qiáng)的自我更新能力，那么在增殖、更新過程中就有可能因外界外環(huán)境等因素影響使基因發(fā)生突變，干細(xì)胞分化走向發(fā)生變化引起惡變，且干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中生存時(shí)間較長(zhǎng)，其發(fā)生突變的機(jī)會(huì)更多，最終形成具有誘發(fā)腫瘤發(fā)生的干細(xì)胞，即 5, 16。 在臨床研究方面，有學(xué)者通過 間充質(zhì)干細(xì)胞（ 共培養(yǎng) 能明顯降低代表細(xì)胞分裂的活性物質(zhì)細(xì)胞周期蛋白 1）、 表達(dá)，同時(shí)可分泌更多的免疫反應(yīng)蛋白，如白介素 及 腫 瘤 壞 死 因 子（ ，說明改變 環(huán)境可有效抑制其分化增殖，可推定對(duì)膠質(zhì)瘤治療可能有效。 有學(xué)者認(rèn)為，同時(shí)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和自我更新的基因在 擇巢蛋白（ 標(biāo)志物進(jìn)行膠質(zhì)瘤起源的研究，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)鼠的室管膜下區(qū)存在 著時(shí)間增加，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為實(shí)體瘤細(xì)胞，為 有學(xué)者認(rèn)為單一細(xì)胞經(jīng)過一定周期的突變后也可向惡性轉(zhuǎn)變，如 17認(rèn)為單一細(xì)胞經(jīng)過 4織更新越快，基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中發(fā)生突變的幾率就越高， 易在分化過程中發(fā)生突變引起惡性變，可能轉(zhuǎn)化為 于是星形細(xì)胞瘤、蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 8717 少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤還是室管膜瘤取決于轉(zhuǎn)化過程中 有推測(cè)認(rèn)為它可能起源于已分化的細(xì)胞 ,由這些細(xì)胞突變發(fā)生去分化得來 ,并通過基因突變而獲得了干細(xì)胞自我更新的特性 ,從而形成 前 來也有學(xué)者提出 可能是有不同的 18，這些亞群主要區(qū)別在于其表面標(biāo)志物、逃逸能力、誘導(dǎo)供瘤血管生成能力及遷移侵襲能力等方面，且不同的干細(xì)胞亞群在腫瘤生長(zhǎng)發(fā)生中充當(dāng)不同角色，這也說明 在病理類型上有不 同的差異。但這些起源均為一些學(xué)說或假說，尚不完全肯定。 沒有確切理論支持，還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。其表面標(biāo)志物 有些 不代表其不是 有待發(fā)現(xiàn)更多新的標(biāo)志物來鑒別進(jìn)一步研究提供幫助。 不管基礎(chǔ)研究從哪個(gè)方向、用哪種方法，其最終目的都是為臨床服務(wù)，為廣大膠質(zhì)瘤患者的診斷、治療及預(yù)后提供可行的方法與依據(jù)。膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后判斷目前